微管蛋白(tubulin)是α、β两种多肽链所形成的异二聚体。这两种亚基由高度保守且分散的基因或小基因家族所编码。对微管系统的大量细胞结构和亚细胞结构的形态学观察，以及微管蛋白生化特性与集合组装的分析，丰富了细胞骨架系统的内容。 驱动蛋白(kinesin)富含于各种类型细胞、细胞发育的各个阶段以及所有多细胞有机体，大多数出现在细胞质中，一些与多种联膜的细胞器(organell)相联结，包括小囊泡和内质网等。它是由两条120KDa的重链(α链)和两条70KDa的轻链(β链)构成的四聚体。它是主管细胞器和囊泡运输的重要马达蛋白，除参与细胞核的融合、纺锤体的形成与分离、染色体的迁移等细胞生理活动外，还在调节微管解聚速度、保持微管稳定及细胞膜损伤的修复中具有一定作用。 脑组织耗氧量大，是体内能量代谢十分活跃的器官之一。脑对缺氧耐受力极差，3-5分钟严重缺氧对大脑产生明显的功能损害，处于完全缺氧状态5分钟后，神经元功能难以恢复，缺氧30分钟后造成永久的不可逆的神经损害，尤其是脑皮层及皮层下视觉通路神经元最不耐受缺氧。脑对缺氧耐受性差与脑内ATP高稳定水平有关，即脑ATP迅速生成及迅速利用。缺氧分子机制的研究是医学的前沿和热点。 大鼠β微管蛋白基因的合成及原核表达 将大鼠β微管蛋白编码序列上游156-480bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成16个单链片段，F1-P8和R1-R8，采用化学合成方法合成。F1和R1长39bp，其它片段均38bp，F1和R1片段两端分别加上限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的识别位点序列。通过人工合成，经多次PCR，获得了预先设计序列，并成功构建了β-微管蛋白的克隆载体及原核表达载体，获得了其表达的蛋白，作为良好的半抗原免疫动物，并且获得了大鼠β微管蛋白多克隆抗体。本研究主要利用基因工程手段和蛋白重组技术构建了大鼠β微管蛋白基因原核表达载体，并成功进行了原核表达，获取β微管蛋白产物及其多克隆抗体，进而测定缺氧条件下大鼠体内微管蛋白的表达情况，从而为研究缺氧条件下动物的生理变化及应采取的相应措施打下基础。 中药复方制剂对缺氧大鼠β微管蛋白表达水平的影响 经透析袋电洗脱法和侧带法纯化后采用常规方法免疫成年家兔并获其相应多克隆抗体，然后对其进行 ELISA检测、Weste。bloning分析，表明此蛋白具有良好的抗原性。实验动物采用健康成年Wstar大鼠，随机分为2组，分别为实验组和对照组，实验组按 4．sg／kg体重，腹腔注射中药复方提取液（浓度为 ig生药／ml人对照组腹腔注射等体积火菌生理盐水。注射后 30mifl进行常压耐缺氧实验。常压缺氧条件：1．SL干燥器，放入钻石灰gog。本试验对大鼠脑、心、肝、脾、骨骼肌利用SP免疫组化染色试剂盒进行免疫组织化学分析，研究了p微管蛋白在大鼠体内的定位，并且比较了大鼠在缺氧前后p微管蛋白的表达影响。结果显示缺氧前后p微管蛋白的表达差异显著。 中药复方制剂对缺氧大鼠p微管蛋白基因和驱动蛋白基因的mRNA表达水平的影响 实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术。本实验采用实时荧光定量PCR技术研究中药复方制剂对缺氧条件下大鼠微管蛋白和驱动蛋白表达的影响。 引物和探针设计 分别依据微管蛋白、驱动蛋白以及a－。n基因序列设计3对引物，在3对引物扩增片段中间分别设计3条探针，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6一核基荧光素）；靠近3’端标以荧光淬灭基因IAMltA （6一核基四甲基若丹明）； 各基因cDNA的扩增 提取大鼠各组织总RNA，取等量的RNA立即进行反转录。反转录引物为OligO＊T，RTPCR产物经琼脂糖电泳检测到目的带。 定量PCR 用所得的。DNA为模板，分别加入各引物和探针，用荧光定量PCR仪检测其荧光密度增加，利用荧光定量PCR仪数据分析软件对其进行分析，表明中药复方制剂对大鼠在缺氧条件下五种组织（脑、心、肝、脾、骨骼肌）中p微管蛋白和驱动蛋白InRNA的表达有较明显的差异。