论文部分内容阅读
植物角质层蜡质是植物抵御外界环境胁迫的第一层屏障。MAH1基因是细胞色素P450中CYP96家族成员之一。在拟南芥中,MAH1被认为编码植物角质层蜡质脱羰基途径中的烷羟化酶,催化烷烃羟基化形成次级醇和酮,而MAH1在甘蓝型油菜中的研究还未见报道。本试验通过电子克隆与RT-PCR技术,分离获得了两个甘蓝型油菜MAH1的全长编码区序列,分别命名为BnMAH1-1和BnMAH1-2,并进行了相关生物信息学的分析与预测;通过实时荧光定量PCR技术检测了这两个成员的组织器官特异性表达特征,激素处理后的诱导表达模式,并通过比较这两个基因成员在有蜡粉与无蜡粉材料中的表达差异初步探索了在蜡质合成中的功能;同时,利用双酶切技术构建了BnMAH1-1的超表达载体和RNAi载体,为进一步利用转基因功能研究奠定基础。主要实验结果如下:1、甘蓝型油菜烷羟化酶基因BnMAH1-1和BnMAH1-2成员的克隆与序列分析利用甘蓝型油菜基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/203),以拟南芥MAH1基因序列为探针,电子克隆得到2个ORF序列。通过PCR和RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆得到了这两个ORF序列,分别命名为BnMAH1-1(基因登录号:KT795344)和BnMAH1-2(基因登录号:KT795345),其ORF长度均为1491bp,无内含子,G+C含量均为43.1%,二者的核苷酸序列一致性为92.4%,与拟南芥MAH1基因一致性分别为85%和86.4%。二者在氨基酸水平上有90.9%的序列一致性和94.0%的相似性。NCBI blastn与氨基酸序列多重比表明两者与预测的甘蓝的MAH1同源性最高,其次是白菜,然后是拟南芥MAH1。通过P450亲缘系统发生进化树表明,BnMAH1-1和BnMAH1-2与拟南芥MAH1/CYP96A15亲缘关系最近。根据核苷酸预测的BnMAH1-1和BnMAH1-2预前体蛋白均为496个氨基酸组成的多肽链,分子量(Mw)分别为57.06kDa和56.92kDa,等电点分别为8.76和8.33。预测的BnMAH1-1和BnMAH1-2蛋白均为亲水蛋白,存在信号肽序列。BnMAH1-1和BnMAH1-2二级结构主要由α螺旋(38.10%、40.12%)和无规则卷曲(35.28%、32.66%)构成,而β转角(8.27%、8.06)和延伸链(18.35%、19.15%)散布于整个蛋白质中。三级结构预测表明bnmah1-1和bnmah1-2均是细胞色素p450蛋白,并且含有一个保守的血红素结合域f436xxgxrxcxg445。2、bnmah1-1和bnmah1-2基因的表达分析实时荧光定量pcr以及半定量结果分析表明,bnmah1-1与bnmah1-2基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花、及角果中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,其次是角果与茎,二者在根系中的表达量最低。这表明bnmah1-1和bnmah1-2可能活跃地参与了甘蓝型油菜地上部分、尤其是叶片角质层蜡质的沉积。对bnmah1-1和bnmah1-2在有蜡粉材料与无蜡粉材料中的差异表达分析结果表明,bnmah1在有蜡粉材料茎、叶中的表达量远远高于无蜡粉材料,bnmah1-1和bnmah1-2在无蜡粉材料叶片中几乎不表达,表明蜡质的减少与mah1的转录下调有关。外源激素meja诱导6h后,bnmah1与ja信号途径标志基因pdf1-2在渝油19中表达显著上调,在中双9中表达均下调。乙烯合成促进剂acc显著诱导了乙烯信号途径标志基因erf2的表达,bnmah1在渝油19中表达无显著变化,在中双9中表达下调。sa处理6h后,sa信号途径标志基因pr1表达显著上调,而bnmah1在两品种中表达均下调。3、bnmah1-1超表达载体与rnai载体的构建设计了带有saci/xmai酶切位点序列的pcr引物,从油菜总cdna中扩增获得bnmah1-1的全长编码序列,经测序验证正确后,利用xmai+saci双酶切技术将超表达序列最终克隆到pcambia2301g载体上,得到了携带目的基因的重组载体pcambia2301g-bnmah1-1,依次转化大肠杆菌及根癌农杆菌lba4404,获得了携带bnmah1-1的植物超表达载体的工程菌株。根据bnmah1-1的保守区域设计rnai片段引物,利用pcr克隆rnai片段,将其反义片段与正义片段采用noci+aatii和bamhi+xbai分别插入到植物rnai基础载体pfgc5941m的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成重组rnai载体pfgc5941m-bmah1-1i,pcr检测表明载体构建成功,并转化根癌农杆菌获得工程菌株。超表达载体与rnai载体的构建为进一步通过植物转化进行基因功能研究奠定基础。4、甘蓝型油菜烷羟化酶基因bnmah1-1超表达载体的遗传转化通过农杆菌介导法,将甘蓝型油菜烷羟化酶基因BnMAH1-1超表达载体载体pCambia2301G-BnMAH1-1的工程菌株转化甘蓝型油菜中双11号的下胚轴,获得了19株抗Kan的再生植株。经PCR检测表明其中8株是转基因阳性植株。