论文部分内容阅读
竹子成材快是其在生产生活中发挥重要作用的原因之一,纤维素是细胞壁的重要组分,对竹材材性具有重要影响,因此研究纤维素的合成与调控对揭示竹材形成机制具有重要意义。COBRA是一种糖基磷脂酰基醇锚定蛋白(GPI-APs),对植物细胞壁纤维素的合成与沉积具有重要调节作用。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为对象,利用生物信息学方法对其中COBRA家族成员进行了全基因组分析,并对PeCOBL7的功能进行了初步研究,以期为揭示毛竹速生机制提供理论依据。主要的研究结果如下:(1)采用生物信息学方法,在毛竹中鉴定出14个COBL家族同源基因(PeCOBL1~PeCOBL14),可分为2个分支,其中6个具有完整的编码区。采用RT-PCR的方法,克隆了4个不完整基因(PeCOBL7~PeCOBL10)的编码区,长度分别为2 004 bp、2 001 bp、1389 bp和1 368 bp。对14个PeCOBLs定位分析表明,PeCOBL1和PeCOBL4、PeCOBL5和PeCOBL11以及PeCOBL6和PeCOBL12分别定位到3个不同的Scaffold上,其他PeCOBLs分别定位在不同Scaffold上。PeCOBLs编码氨基酸长度为437~667个氨基酸,分子量在48.40~72.14 k D之间,理论等电点在5.64~9.02之间。PeCOBLs为亲水性蛋白。亚细胞定位预测PeCOBLs均为膜蛋白。蛋白序列保守性分析表明,PeCOBLs均含有GPI-AP家族特征结构域和富含半胱氨酸的结构域(CCVS/T),均含有N端信号肽,GPI锚定信号。(2)基因共表达网络分析表明,PeCOBLs与多种蛋白酶基因、转录因子基因等呈现共表达,其中5个PeCOBLs与13个CESA亚家族基因和2个CSL亚家族基因共表达。除PeCOBL2与PeCSLE基因呈负向共表达外,其他4个PeCOBLs均与纤维素合成酶超家族基因呈正向共表达。PeCOBL7、PeCOBL8与PeCSLD三者之间呈正向共表达;与PeCOBL9和PeCOBL10正向共表达的基因PeCESAs分别有6个和7个。利用毛竹7个不同组织的转录组数据,对PeCOBLs和纤维素合成酶超家族基因的表达模式分析表明,PeCOBLs与其正向共表达的PeCESAs表达模式相似,从一定程度上支持了共表达网络的预测。(3)q RT-PCR分析发现,PeCOBLs在毛竹不同组织中的表达具有差异性,在展开叶中表达量高的基因在未展开叶中表达量低,其中PeCOBL7、PeCOBL9和PeCOBL10均在茎中表达量最高;PeCOBLs在不同高度笋中的表达差异明显,其中PeCOBL6、PeCOBL7和PeCOBL8在笋发育后期上调幅度较大,PeCOBL7在4.0 m笋中是0.5 m笋中的5倍。同时发现,在不同高度笋中PeCOBL9和PeCOBL10均与共表达的PeCESAs的表达具有相似的变化趋势。由此表明,这些PeCOBLs和PeCESAs共表达基因在毛竹中具有协同作用共同影响笋的生长。(4)对PeCOBL7上游启动子区域分析发现,其中包含多种植物激素和环境胁迫响应元件和顺式作用元件。对PeCOBL7在不同高度笋基部第一节间上、中和下部的表达分析发现,其在同一笋节的不同位置表达量具有差异性,在上部的表达量均较低;在6.0 m笋的中部和4.0 m笋的下部表达量最高,表明其在毛竹的叶片成熟期和竹笋发育盛期发挥重要作用。构建PeCOBL7的植物表达载体,采用蘸花法转入野生型拟南芥。经抗性筛选和DNA水平验证,共获得了9个过表达转基因株系。观察表型发现,转基因植株比拟南芥野生型和突变体的生长速度快,生长健壮。本研究全面分析了毛竹中COBRA家族成员的分子特征,研究了10个PeCOBLs的表达模式,初步揭示出PeCOBLs和PeCESAs存在共表达关系并共同影响笋的生长,获得了生长快的PeCOBL7转基因拟南芥植株。研究结果对于深入研究毛竹COBRA家族基因在纤维素合成过程中的功能提供了参考。