论文部分内容阅读
家蚕（Bombyx mori Linnaeus）的蛹期在实际生产生活中，一般维持在两周左右，但是通过延长蛹期，可以节约大量花费在鲜茧加工过程中的人力物力。本文旨在利用Gal4/UAS酵母双杂交系统，蛹期特异性表达启动子介导，控制东亚钳蝎毒素基因（BmKIT3R，Chinese scorpion Buthus martensii Karsch）特异性地在家蚕蛹期表达。Gal4蛋白由蛹期特异性表达启动子，家蚕翅原基细胞蛋白BmWCP4(B.mori wing-cuticle protein gene)或家蚕溶茧酶PDP(B.mori cocoonase gene)控制；BmKIT3R基因由可以被Gal4蛋白特异性识别的UAS(cis-acting element)序列控制表达，双元系统的激活系统和效应系统都装载在piggBac转座子载体上。piggyBac载体中含有由家蚕多角体病毒BmNPV ie-1（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus immediate-early gene）极早期基因启动子控制的新霉素抗性基因（neomycin-resistance gene，neo），以及家蚕A3(B. mori actin3)基因启动子控制的绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein gene，gfp）。载体被精子介导法导入家蚕受精卵，经绿色荧光蛋白观察和G418筛选，制得转基因家蚕。经传代后提取家蚕基因组，用PCR验证家蚕基因组中存在gfp与neo基因。双元系统杂交种的幼虫与对照组Gal4ˉ和UASˉ的种系相同，并无发育滞缓的情况，而在蛹期，前者因双元系统控制的BmKIT3R基因的表达，有些在蛹期死亡，有些蛹期发育迟缓，而对照组正常发育化蛾。并且，在Gal4/UAS双元系统中，BmWCP4的启动效果在试验中优于PDP的启动效果。双元系统杂交种UAS-BmKIT3R(3-247)×BmWCP4-Gal4(大造),UAS-BmKIT3R(3-247)×PDP-Gal4(3-166)和UAS- BmKIT3R(3-247)×PDP- Gal4(3-247)的蛹期延长效果较对照组而言，分别延长5天，2天和4天。从本文研究结果得出，Gal4/UAS介导的BmKIT3R基因在蛹期特异性表达阻滞蛹期发育，是延长家蚕蛹期的很好方法。