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Ⅰ.水稻Pid3抗病途径相关基因Pstpk1的功能研究水稻是我国主要粮食作物,稻瘟病是影响水稻产量的主要病害之一。目前,挖掘抗稻瘟病基因,并用其培育抗病品种是减轻稻瘟病危害最经济有效的方法。之前,在水稻地谷中克隆到一个稻瘟病抗性基因Pid3,其编码一个典型的CC-NBS-LRR蛋白。Pid3对稻瘟菌生理小种Zhong10-8-14具有特异性抗性,但Pid3介导的ETI(Effector-triggered Immunity)途径的分子机制尚不清楚。在先前的研究中,为探索Pid3介导的ETI途径的分子机制,对水稻材料Pid3-TP309分别用非亲和菌株和亲和菌株进行处理后提取蛋白,并运用GST pull-down技术筛选到在Pid3抗病反应中特异与PID3互作的候选蛋白。本文在此基础上对其中一个候选蛋白进行了功能分析。经分析发现该蛋白为丝氨酸/苏氨酸激酶(Serine/threonine protein kinase),且目前并无该蛋白参与调控稻瘟病抗性方面的报道,我们将其命名为Pstpk1(Pid3 interaction serine/threonine protein kinase 1)。为探索Pstpk1在Pid3介导的ETI中的功能,分别在Pid3-TP309和TP309背景下对Pstpk1过表达、敲除或干涉,并进行抗性鉴定;并对PSTPK1进行了亚细胞定位研究;同时,开展了酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(Bi FC)实验,以验证PSTPK1与PID3之间的互作关系,。本文主要研究结果如下:1、为探究Pstpk1是否参与Pid3介导的ETI,分别构建了Pid3-TP309遗传背景下Pstpk1基因的敲除株系和过表达株系。对敲除株系和过表达株系接种Zhong10-8-14并鉴定其抗病表型,发现Pstpk1敲除植株与对照Pid3-TP309相比,病斑大小没有变化;但过表达植株更感病。以上结果表明,Pstpk1在Pid3介导的抗病反应中可能起负调控作用。2、为探索Pstpk1是否调控基础免疫PTI(Pattern-triggered Immunity),分别构建了TP309背景下的Pstpk1基因干涉株系和过表达株系。对干涉株系和过表达株系接种Zhong10-8-14鉴定其抗病表型,发现干涉株系、过表达株系与TP309三者之间的病斑大小没有差异。以上结果表明,Pstpk1对水稻基础免疫无明显调控作用。3、利用水稻原生质体进行亚细胞定位研究,结果发现PSTPK1-GFP融合蛋白在细胞核和细胞质都有信号,但主要集中在细胞核中。4、为探究PID3与PSTPK1互作关系,构建了PSTPK1与PID3的Bi FC载体和Y2H载体。结果显示,PSTPK1与PID3在烟草和酵母系统中均不存在互作关系。结合先前运用GST pull-down筛选PID3互作蛋白的结果来看,PSTPK1与PID3的互作可能依赖于病原菌的诱导。Ⅱ.bsr-d1抗性位点的育种应用在本研究中,将一个具有广谱抗性抗病基因bsr-d1应用于蜀恢527的抗性改良育种。我们鉴定了改良系的稻瘟病抗性,并考察了遗传背景的回复率以及农艺性状,发现改良株系对稻瘟病的抗性提高,且综合农艺性状和蜀恢527没有显著差异。以上结果表明广谱抗性抗病位点bsr-d1在显著提高蜀恢527抗性的同时,不影响主要农艺性状,因此其具有重要的育种利用价值。主要研究结果如下:1、利用Bsr-d1基因的启动子区域的变异位点,设计相应的分子标记Bsr-d1-d CAPS,通过检测后发现标记在供体亲本和受体亲本之间有较好的多态性,可用于分子标记辅助筛选。2、通过亲本蜀恢527与改良系不断回交,并与分子标记辅助选择相结合,获得了3个抗病改良系。分子标记检测结果显示,蜀恢527改良系中的bsr-d1基因已纯合。3、为鉴定改良株系的抗性,采用强致病性的稻瘟病菌株对蜀恢527改良株系、蜀恢527、丽江以及地谷进行接菌处理,结果表明,蜀恢527的3个bsr-d1基因改良株系抗性级别都有明显提高。4、利用地谷与蜀恢527之间的基因多态性标记,对3个改良株系的遗传背景回复率进行了分析,发现改良株系的遗传背景回复率为94%以上。5、用SPSS statistica20对抗病改良系的主要农艺性状进行考察,包括株高、有效穗、穗长、结实率、千粒重。检测结果显示,有效穗和千粒重没有明显变化,其他性状都有显著性差异。