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西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起的细菌性果斑病(baeterial fruitbloteh of watermelon,BFB)是一类为害葫芦科植物的重要细菌病害,在世界的大多数国家和地区都有分布,造成严重的经济影响。西瓜噬酸菌也是我国的检疫性有害生物,目前关于该病原物的研究主要集中在检测防治方面,但是关于它的致病机制以及侵染途径方面的研究相对较少。因此本研究的目的就是克隆致病相关基因,并对其进行功能分析。
利用转座子(Mini-Tn5)对AcidovoraxcitrullistrainxjL12(Ac xjL12)进行转座诱变,构建了西瓜噬酸菌AcxjL12的转座子插入文库。以接种哈密瓜幼苗的方法筛选得到两株株致病力完全丧失的突变株△xj13、△xj48,通过亚克隆的方法,鉴定了△xj13、△xj48的Mini-Tns插入位点分别为PyrG基因、hPaP基因。
利用自杀载体pVIKI12,应用两亲交配的方式,构建了插入失活突变体今双FrG和△pyrG,并对其功能进行了初步分析。研究表明△pyrG、△hpaP丧失了对哈密瓜幼苗的致病性,这个结果与△xj13、△xj48一致;通过基因互补,分别构建了互补菌株PyrGhb、hPaPhb,互补菌株都基本恢复了对哈密瓜子叶的致病性。分别将野生型、突变株以及互补菌株接种烟草,发现△xj13、△xj48、△pyrG、△hpaP、hPaPhb都丧失了引起过敏性反应的能力,而pyrGllb恢复引起过敏性反应的能力;随后还对突变体的其他表型进行了研究,发现基因PyrG、phaP突变后影响了AcxjL12的游动性、生物膜的形成能力,还影响了病原菌的定殖能力;反转录差异显示hpaP基因的突变对hrcF基因的表达有影响,PyrG基因的突变对hisD基因的表达有影响;MMx培养基中添加组氨酸的生长曲线测定表明PyrG基因的突变影响西瓜噬酸菌对组氨酸的利用口证实了西瓜噬酸菌中的PyrG、hpaP基因与该细菌的致病力相关,在其生长过程和侵染过程中起着不可缺失的作用。
利用转座子(Mini-Tn5)对AcidovoraxcitrullistrainxjL12(Ac xjL12)进行转座诱变,构建了西瓜噬酸菌AcxjL12的转座子插入文库。以接种哈密瓜幼苗的方法筛选得到两株株致病力完全丧失的突变株△xj13、△xj48,通过亚克隆的方法,鉴定了△xj13、△xj48的Mini-Tns插入位点分别为PyrG基因、hPaP基因。
利用自杀载体pVIKI12,应用两亲交配的方式,构建了插入失活突变体今双FrG和△pyrG,并对其功能进行了初步分析。研究表明△pyrG、△hpaP丧失了对哈密瓜幼苗的致病性,这个结果与△xj13、△xj48一致;通过基因互补,分别构建了互补菌株PyrGhb、hPaPhb,互补菌株都基本恢复了对哈密瓜子叶的致病性。分别将野生型、突变株以及互补菌株接种烟草,发现△xj13、△xj48、△pyrG、△hpaP、hPaPhb都丧失了引起过敏性反应的能力,而pyrGllb恢复引起过敏性反应的能力;随后还对突变体的其他表型进行了研究,发现基因PyrG、phaP突变后影响了AcxjL12的游动性、生物膜的形成能力,还影响了病原菌的定殖能力;反转录差异显示hpaP基因的突变对hrcF基因的表达有影响,PyrG基因的突变对hisD基因的表达有影响;MMx培养基中添加组氨酸的生长曲线测定表明PyrG基因的突变影响西瓜噬酸菌对组氨酸的利用口证实了西瓜噬酸菌中的PyrG、hpaP基因与该细菌的致病力相关,在其生长过程和侵染过程中起着不可缺失的作用。