大鳍鳠IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

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白细胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)是白细胞介素1家族的重要成员之一。IL-1β作为一类促炎反应的前期细胞因子,通过介导一系列反应而诱发炎症,同时还具有提高组织抗感染的能力。研究表明多种刺激因素都可导致鱼类IL-1β的表达量发生变化,这预示着IL-1β可能在鱼类抵御疾病的生理过程中发挥重要作用。大鳍鳠(Mystus macropterus)作为长江及珠江流域特有的经济鱼类,在养殖过程中经常受病原菌感染而发生死亡。因此,探讨IL-1β基因在大鳍鳠抗病反应中表达量的变化,以期进一步阐明IL-Iβ基因在鱼类抗病过程中的作用。本研究采用简并引物PCR、RACE和巢氏PCR法,克隆了大鳍鳠的IL-1β cDNA的基因序列。在此基础上,运用半定量PCR方法,研究了大鳍鳠在未受刺激的情况下IL-1β基因的组织分布,以及在经嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)和脂多糖(LPS)刺激后,IL-1β基因的表达变化规律。主要结果如下:大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1194bp (GenBank登录号:JN646749),3’非编码区域(UTR)为224bp,其中含有3个RNA不稳定基序ATTTA(RNA instability motifs),同时还含有30个碱基的poly(A)尾,在poly(A)尾上游17bp处可见poly(A)加尾信号AATAAA。5’UTR为82bp,开放阅读框(ORF)为888bp,编码296个氨基酸。对克隆到的序列进行分析,预测的蛋白质分子量为33.84343kD,等电点为5.00。存在IL-1家族的标签序列FESVRYPGWFITTSKDDFKPV。发现大鳍鳠IL-1β序列中不存在信号肽和白细胞介素-1转换酶(interleukin-1conveting enzyme,ICE)的切割位点。与斑点叉尾鮰等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾鮰相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾鮰聚为一支。组织分布分析表明,IL-1β基因在大鳍鳠各检测组织器官中呈组成型表达,在头肾、脾脏中表达量最高,在肾、肌肉、胃、皮肤、肝脏及肠中的表达量次之,而在脑中表达量最弱。经嗜水气单胞菌刺激后,大鳍鳠头肾和脾脏中IL-1β基因的表达量变化的总体趋势相近,都是随时间先升高再下降至正常水平。注射嗜水气单胞菌4h后头肾和脾脏中的表达量均开始明显增加,1d后表达量达到最高,随后表达量开始有所降低,15d后恢复到未刺激的水平。经LPS刺激后,大鳍鳠IL-1β的表达量变化较嗜水气单胞菌刺激更为敏感,头肾和脾脏的表达量总体趋势都表现为先快速增加,后随着刺激时间的延长而逐渐恢复至对照水平。注射LPS2h后头肾和脾脏中的表达量均开始明显增加,4h后表达量达到最高,随后表达量开始下降,1d时表达量较4h时的稍有下降,3d时的表达量较1d时的已有大幅度下降,7d时的表达量恢复到刺激前的水平。结果表明大鳍鳠IL-1β基因对细菌及LPS的刺激反应敏感,提示该基因在机体抵御革兰氏阴性菌引起的疾病过程中起着重要作用。
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