维药没食子有效部位的抗辐射作用研究

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目的:用高分子材料MCI、ODS分离没食子丙酮提取物得到不同制备部位,比较没食子不同制备部位的有效成分总鞣质和没食子酸的含量,为筛选没食子有效部位对辐射防护作用的研究提供物质保障。选择有效成分含量高,干粉得率高的制备部位进行细胞学研究。利用现代生物学技术对没食子有效提取部位抗辐射作用进行研究和探讨,发现其可能的辐射防护机制。方法:1.以MCI为分离材料,采用甲醇-水系统对没食子丙酮提取物进行柱层析分离,再以ODS为分离材料,采用甲醇-水系统对没食子MCI提取物进行柱层析分离。以没食子酸为对照品,分别采用干酪素比色法和HPLC法测定没食子药材、没食子不同制备部位中总鞣质和没食子酸的含量。选择有效成分含量高、干粉得率高的制备部位进行细胞学实验。2.由于淋巴细胞对辐射反应极其敏感,所以采用8Gy X射线一次性照射人淋巴母细胞(AHH-1)构建辐射损伤模型,实验分组为阴性对照组、模型组、5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml没食子MCI提取物组,用MTT法筛选最佳辐射防护剂量。在此剂量用PI单染色法检测细胞周期,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平,Western blot法考察介导细胞凋亡的线粒体途径和caspase-3家族等信号通路变化,影响细胞凋亡Bax、Bcl-2、caspase-3、JNK、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白的表达。结果:1.不同提取部位没食子酸含量差异明显,其中以ODS水提部位含量最高达到54.6%,没食子药材含量为5.76%,ODS水提部位是没食子药材没食子酸含量的9.48倍。不同提取部位总鞣质含量(除ODS水提部位)均比没食子药材含量明显的增高,其中以MCI的40%甲醇最高为63.53%,没食子药材为42.85%。综合没食子酸和总鞣质含量测定结果,结合不同提取部位干粉得率情况,选择MCI的40%甲醇提取部位进行抗辐射活性细胞学研究。2.辐射可导致AHH-1大量凋亡。5μg/ml和25μg/ml没食子MCI提取物组能够提高X射线辐射AHH-1的存活率,以5μg/ml组效果最明显(P<0.01)。5μg/ml没食子MCI提取物可明显降低辐射作用的细胞G1期阻滞,对辐射造成细胞S期延迟、G2期阻滞也有一定影响。5μg/ml没食子MCI提取物可明显抑制辐射导致的细胞早期、晚期凋亡(P<0.01)。5μg/ml没食子明显降低辐射作用于细胞ROS水平(P<0.01),没食子MCI提取物组细胞ROS水平是模型组的11.43%(P<0.01)。结论:通过有效成分含量测定结果分析表明MCI或ODS柱层析没食子丙酮提取部位,可以对没食子药材在充分利用、提高药效、单体获得等方面提供新思路。低剂量(5μg/ml)的没食子MCI提取物对X射线辐射后AHH-1有明显提高细胞存活率,缓解细胞G1期阻滞,明显降低细胞的凋亡,大幅减少辐射产生的活性氧的作用。抗辐射作用机制可能与没食子MCI提取物抗氧化作用强,能维持细胞原有通路的平衡和稳定,降低辐射诱导线粒体释放细胞色素C和促细胞凋亡bax蛋白,抑制诱导凋亡的MAPK信号通路有关。研究证明没食子有效提取部位的确有较好的辐射防护作用,为开发新型天然辐射防护药奠定基础。
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