大肠杆菌O157:H7是一种重要的肠道致病菌，是肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli, EHEC)的一个主要菌型。近年来，屡屡在国内肉制品中检测到大肠杆菌O157感染。它可导致人急性食物中毒，是国家规定必检的病原菌。该菌在世界各地都有不同规模的暴发流行，其感染具有潜在的暴发流行趋势、强烈的致病性、致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，目前已成为全球性的公共卫生问题，所以对该菌进行有效的防控研究成为当前亟需解决的问题。为了更好掌握该菌在动物群体中的感染情况及其流行菌株的分子特征，为控制其在人畜中的流行提供参考依据，作者进行了以下研究。1.基于大肠杆菌O157:H7参考菌株的rfbE、fliC、eaeA三个基因建立三重PCR检测方法，了解大肠杆菌O157:H7在本地区的流行情况。对三重PCR反应体系的退火温度、退火时间、引物浓度、Mg2+浓度和PCR循环次数进行优化，并对该方法的敏感性、特异性进行了评价。用该方法对动物粪便样品进行检测，结果表明本方法具有极高的特异性，敏感性可达到103cfu/mL，并从临床样品中分离鉴定到大肠杆菌O157:H7菌株。本研究成功建立了大肠杆菌O157:H7三重PCR检测方法，并可应用于临床样品检测，为大肠杆菌O157:H7的分子流行病学调查提供了一种新的检测方法。2.利用常规细菌分离鉴定方法对来自河南省各地市以及甘肃、广西、四川等地的2067份样品进行了大肠杆菌O157:H7的分离鉴定。从这些粪样中分离到6株O157:H7菌株，3株O157:H?菌株，并综合血清学方法、生化反应、分子生物学方法对分离株进行了鉴定。由常规细菌分离方法分离到的大肠杆菌O157菌株与血清学方法、生化反应、PCR鉴定结果相一致，属于大肠杆菌O157菌株。虽然从样品中分离到的O157菌株阳性率很低，而目前大肠杆菌O157也没有出现大的爆发，但是在临床样品中毕竟有该菌的存在，说明目前该菌仍然存在潜在的暴发危险，仍然需要加强对该菌的监控和预警。3.为了更好地了解大肠杆菌O157各分离株之间的系统发育关系，并进一步确定大肠杆菌O157分离株的进化地位及其溯源。本研究以大肠杆菌O157:H7分离株和O157:H?分离株为研究对象，根据GenBank上登录的相关序列，针对大肠杆菌的三个管家基因16S rRNA、gyrB、recA以及两个志贺毒素基因stx1、stx2设计引物，进行PCR扩增、克隆、序列测定，并且通过构建进化树来进行系统演化分析。结果表明，大肠杆菌O157分离株与阳性参考菌株在基于三个管家基因所建立的进化树上种系发育关系非常接近；对毒力基因分析发现，2株O157:H?菌株不含stx2基因，1株O157:H?菌株不含stx基因；通过进化树进行溯源分析，可推测出各分离株的大致起源，本研究为大肠杆菌O157分子流行病学研究和快速溯源提供了参考。4.根据Genbank公布的大肠杆菌O157:H7rfbE和fliC基因序列设计两对引物，并对荧光定量PCR反应条件进行优化，建立检测大肠杆菌O157:H7的双重实时荧光定量PCR反应体系，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。应用该二重实时荧光定量PCR对所有大肠杆菌O157:H7菌株的检测结果均为阳性，对沙门菌、志贺菌、枸橼酸杆菌、巴氏杆菌、肠球菌、链球菌1型、链球菌2型等菌株则为阴性；该方法检测的灵敏度可达2.95×100copies/μL，比普通PCR的灵敏度高103倍；定量检测的批内与批间变异系数均小于2%；本研究建立的荧光定量PCR方法为大肠杆菌O157:H7的临床诊断，以及食品安全检测提供了新的鉴定方法，同时也为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。5.应用多位点可变数量串联重复序列分析技术(MLVA)对大肠杆菌O157:H7进行了分子流行病学分析，初步研究了大肠杆菌O157:H7分离株的基因型，并对MLVA分型方法进行了评价。本研究采用核酸提取、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术，结合BioNumerics(Version5.0)软件，利用上述方法对O157:H7分离株进行基因分型。基于分离菌株6个VNTR位点的重复次数聚类分析结果表明，其分型图谱上呈现一定的多态性。本研究所分离到的大肠杆菌O157:H7菌株的基因型具有良好的多态性，而且MLVA方法分型鉴定能力强，便于网络化和各实验室间进行对比，并且在分子溯源和流行病学调查中可发挥重大作用。