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猪在解剖学,神经生物学、心脏血管、胃肠道和基因组方面与人相似,因此在研究人类疾病时,猪被认为是更好的动物模型,还可作为异种器官移植的供体。由于异种器官移植的深入研究,又将转基因猪的研究推向一个新的高峰。本研究构建两种表达载体,并转染细胞,获得转基因细胞,为生产转基因克隆猪做准备。1、人凝血因子Ⅸ基因和hfat-1基因表达载体的构建(1)从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ (human coagulation factor Ⅸ, hFIX) cDNA序列,同时,PCR扩增出牛生长激素(BGH)polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。(2)改造pCAGDNA3,在Mlu Ⅰ后面,CAGG启动子前端添加Pac Ⅰ、Fse Ⅰ和SfiⅠ三个酶切位点,扩增LoxP-pGK-neo-BGHpA-LoxP并连入pCAGDNA3-CAGG骨架,将人源化的hfat-1基因连入骨架载体构成pC-PGK-neo-hfat-1表达载体。2、猪乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞的分离培养(1)组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化、分离纯化得到猪乳腺上皮细胞。通过形态观察、免疫荧光染色、染色体数目分析,确定获得了纯化的猪乳腺上皮细胞。(2)用胶原酶消化法获得猪胎儿成纤维细胞,所获得的胎儿成纤维细胞具有正常的染色体数目。同时,对猪胎儿成纤维细胞的性别也通过SRY基因PCR方法进行了鉴定。3、转染细胞(1)脂质体法将表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC以相同的条件分别导入猪乳腺上皮细胞和雌性猪胎儿成纤维细胞,结果发现：在两种细胞中的转染效率没有明显差异,线性化质粒为600ng,脂质体为3uL时的条件为最优条件。(2)电穿孔法将pC-PGK-neo-hfat-1表达载体导入猪胎儿成纤维细胞中,经DNA. RNA水平的鉴定后,Cre重组酶特异识别Loxp位点,将两个Loxp位点之间的PGK-neo片段删除,用Puromycin筛选,获得hfat-1-neo-阳性细胞。4、转基因细胞的鉴定(1)经实时定量RT-PCR鉴定,hFⅨ在乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞中均有表达,hFⅨ的表达量在乳腺上皮细胞中显著高于成纤维细胞。(2)经实时定量RT-PCR鉴定hfat-1-neo+、hfat-1-neo-转基因细胞,结果表明未经Cre处理的转hfat-1细胞的表达量明显高于Cre处理的细胞。高效气相色谱分析显示：与野生型细胞相比n-6/n-3的比值在转基因细胞中显著降低,Cre处理过的转hfat-1的细胞降低的更明显。