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第一部分：IL-17在肝细胞肝癌中的作用研究目的：研究IL-17在肝细胞肝癌发生发展中的作用。方法：建立三种小鼠肝细胞肝癌动物模型：皮下异位移植性模型、肝脏原位移植性模型和DEN诱导性模型。利用IL-17敲除小鼠，在肝癌模型中观察肿瘤的发生发展情况。应用CD8中和抗体剔除荷瘤小鼠体内的CD8+T细胞观察肿瘤生长情况。利用RT-PCR和流式细胞术检测Hepa1-6细胞表面IL-17R的表达情况。利用MTT法c法检测IL-17对Hepa1-6细胞增殖和凋亡的影响。利用流式细胞术检测荷瘤的正常小鼠、IL-17-/-小鼠以及额外给予rmIL-17小鼠肿瘤浸润淋巴细胞中免疫细胞亚群（T细胞亚群、效应性T细胞、记忆性T细胞、NK、NKT、Treg、DCs、M、中性粒以及MDSCs）的比例。胞内染色检测CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ的水平。乳酸脱氢酶释放法检测抗原致敏的脾脏淋巴细胞对Hepa1-6细胞的杀伤作用。CBA法检测荷瘤小鼠血清中细胞因子IFN-γ，IL-2和TNF-的水平。CFSE法和流式细胞术检测IL-17对CD8+T细胞增殖和分泌细胞因子的影响。结果：（1）成功建立了三种小鼠肝细胞肝癌动物模型：皮下异位移植性模型、肝脏原位移植性模型和DEN诱导性模型。（2）在小鼠皮下异位模型中，IL-17-/-小鼠的肿瘤生长和WT小鼠相比明显减慢，而额外给予WT小鼠rmIL-17后则能够加速肿瘤的生长；与皮下肝癌模型结果相似，在原位肝癌模型中，IL-17-/-小鼠的肿瘤生长和WT小鼠相比明显减慢，而额外给予WT小鼠rmIL-17后能够显著加速肿瘤的生长；在DEN诱导的肝癌模型中，IL-17-/-小鼠的肿瘤结节的数量明显减少，相应肿瘤结节的体积也较小，而额外给予WT小鼠rmIL-17后能增加肿瘤结节的数量和体积。（3）RT-PCR和流式细胞术检测到Hepa1-6细胞表面有较低水平的IL-17R；MTT结果显示IL-17对Hepa1-6细胞的增殖没有直接作用，既不促进也不抑制其增殖；Annexin-V/PI法结果表明IL-17对Hepa1-6细胞的凋亡也没有直接作用。（4）和WT小鼠相比，IL-17-/-小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+T细胞显著增多，活化和记忆性的CD8+T细胞也增多，但是CD4+T细胞却没有明显变化，调节性CD4+T细胞（Treg）的比例也没有明显变化；表达IFN-γ的CD8+T细胞（CTL）在IL-17-/-小鼠中显著升高，但是表达IFN-γ的CD4+T细胞（Th1）却没有变化；IL-17-/-小鼠血清中IFN-γ，IL-2和TNF-的水平显著高于WT小鼠，额外给予rmIL-17后则进一步下调了这些细胞因子的水平；IL-17-/-小鼠脾脏淋巴细胞和CD8+T细胞的杀伤能力明显强于WT小鼠；剔除CD8+T细胞后IL-17-/-小鼠的肿瘤体积和WT小鼠相比没有差别。（5）IL-17既不能够抑制CD8+T细胞的应答，其分泌的IFN-γ和TNF-的水平没有明显减少；也不能抑制CD8+T细胞的增殖。（6）IL-17-/-小鼠的肿瘤微环境中的粒细胞样（Granulocytic）和单核细胞样（Monocytic）MDSCs均显著减少，体外给予正常小鼠rmIL-17后能显著增加肿瘤局部两类MDSCs的浸润；而DCs，M、中性粒细胞却没有明显变化。结论：IL-17对肝细胞肝癌的发生发展具有促进作用，IL-17不是直接促进肿瘤细胞的增殖，而是通过调节CTLs的抗肿瘤免疫应答来间接发挥促进作用；这一作用可能是通过MDSCs细胞进行的，而非直接抑制CTLs的功能。第二部分：肿瘤微环境中IL-17的来源探究目的：研究肝细胞肝癌发展过程中肿瘤微环境中的IL-17的来源。方法：利用原位肝细胞肝癌模型，通过胞内染色的方法对肿瘤浸润淋巴细胞中能够分泌IL-17的细胞进行筛查，联合使用多种流式抗体对分泌IL-17的细胞进行表型鉴定。利用TCR-Vγ的PCR引物检测肝脏中γδT细胞的亚群。使用TCR-δ-/-小鼠，比较γδT细胞缺失情况下肿瘤的生长情况，ELISA检测荷瘤小鼠血清中IL-17的水平。采用体内剔除Vγ4γδT细胞或者过继性输注WT或IL-17-/-来源的Vγ4γδT细胞的方法观察Vγ4γδT细胞来源的IL-17对肝细胞肝癌的促进作用。流式检测荷瘤小鼠肿瘤微环境中免疫细胞亚群（T细胞亚群、效应性T细胞、记忆性T细胞、DCs、M、中性粒以及MDSCs）的比例。胞内染色检测CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ的水平。结果：（1）CD3+的T淋巴细胞是IL-17的主要来源；CD4+T细胞，CD8+T细胞以及γδT均能够分泌IL-17，而以分泌IL-17的γδT细胞数目最多；γδT细胞产生的IL-17占到所有IL-17+细胞的60%，同时其数量是Th17细胞的四倍多；分泌IL-17的γδT细胞呈现ROR-γt+CD27-CCR6+表型。（2）肝脏中存在所有6种γδT细胞亚群；流式检测表明Vγ4细胞亚群是产生IL-17的主要细胞，75%的分泌IL-17的γδT细胞是Vγ4亚群。（3）敲除了γδT细胞之后，肝细胞肝癌的生长受到了显著抑制；血清中IL-17的水平明显下降；CD8+T细胞的抗肿瘤应答显著增强记忆性的CD8+T细胞显著增加，CD8+T细胞分泌的IFN-γ也显著增加。（4）剔除了Vγ4细胞之后，和WT小鼠比较肿瘤体积明显减小；肿瘤浸润的IL-17+γδT细胞数量显著减少了，但是Th17细胞的数量却没有变化；血清中IL-17的水平也显著下降；CD8+T细胞的抗肿瘤应答显著增强，记忆性的CD8+T细胞显著增加，CD8+T细胞分泌的IFN-γ也显著增加。（5）输注WT来源的Vγ4γδT细胞的TCRδ-/-小鼠其肿瘤体积与WT小鼠相比无差异，而输注IL-17-/-来源的Vγ4γδT细胞的TCRδ-/-小鼠其肿瘤体积显著小于WT小鼠，也显著小于输注WT来源的Vγ4γδT细胞的TCRδ-/-小鼠；输注IL-17-/-来源的Vγ4γδT细胞的TCRδ-/-小鼠具有更强的抗肿瘤应答，记忆性的CD8+T细胞和CD8+T细胞分泌的IFN-γ显著增加。结论：肿瘤微环境中的IL-17的来源，不是获得性免疫的Th17细胞，而是固有免疫的Vγ4γδT细胞亚群。Vγ4γδT细胞来源的IL-17促进了肝细胞肝癌的发生发展。第三部分：IL-17促进肝细胞肝癌发展的机制研究目的：研究IL-17促进肝细胞肝癌发展的具体调控机制。方法：利用RT-PCR和流式细胞术检测MDSCs细胞表面IL-17R的表达情况。Transwell实验检测IL-17对MDSCs的趋化作用。流式细胞术检测MDSCs细胞表面CXCR2和CXCR4的表达情况。Realtime PCR检测IL-17处理的肝癌细胞Hepa1-6趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20、CXCL12和CXCL5的表达水平的变化。Transwell实验检测IL-17处理的肿瘤细胞的上清对MDSCs的趋化作用。给予荷瘤小鼠CXCR2的拮抗剂SB265610或CXCR4的拮抗剂AMD3100以及rmIL-17的联合处理，观察CXCL5/CXCR2轴或者CXCL5/CXCR4轴在IL-17介导的体内MDSCs趋化中的作用。将MDSCs与OT-I来源的CD8+T细胞进行了共培养，并加入rmIL-17或者anti-IL-17，利用特异性的刺激（SIINFEKL）来观察IL-17是否可以增强MDSCs对CD8+T细胞的抑制作用。CFSE和3H-TdR检测MDSCs对CD8+T细胞增殖的影响。利用Gr-1抗体和吉西他滨剔除小鼠体内的MDSCs观察在体内情况下IL-17介导的MDSCs的增强抑制作用。将纯化的MDSCs与γδT细胞进行了共培养，利用流式和ELISA方法检测共培养体系中γδT细胞分泌IL-17的水平。在共培养体系中加入IL-1β和IL-23的中和抗体研究MDSCs促进γδT细胞产生IL-17的机制。在MDSCs与γδT细胞共培养体系中加入了外源的rmIL-17和IL-17的中和抗体，研究IL-17对MDSCs诱导γδT细胞分泌IL-17的增强效果。结果：（1）流式细胞术和RT-PCR的方法检测发现MDSCs表达IL-17R，但是体外趋化实验表明IL-17不能直接诱导MDSCs迁移。（2）MDSCs表达CXCR2和CXCR4这两种趋化因子受体；IL-17处理后的肿瘤细胞可以显著上调CCL2、CCL5、CCL7、CCL20、CXCL12和CXCL5的表达；但是检测肿瘤微环境中这些趋化因子的表达水平后发现，只有CXCL5具有明显的上调；Transwell实验表明，IL-17处理后的肿瘤细胞上清可以显著促进MDSCs的迁移，且具有剂量依赖性，当加入anti-IL-17或者CXCR2的拮抗剂SB265610后可以显著抑制这一趋化作用。（3）给予rmIL-17的荷瘤小鼠经CXCR2的拮抗剂SB265610处理后肿瘤显著减小，肿瘤局部的MDSCs数量也显著降低，机体CD8+T细胞的抗肿瘤免疫应答也随着MDSCs的减少而显著增强。（4）CFSE和3H-TdR实验均表明IL-17可以增强MDSCs对CD8+T细胞的增殖，细胞因子分泌实验表明IL-17还可以以剂量依赖性的方式增强MDSCs对CD8+T细胞分泌IFN-γ和TNF-的抑制作用，IL-17主要显著增强单核细胞样MDSCs对CD8+T细胞的抑制功能。（5）剔除rmIL-17处理的荷瘤小鼠内的MDSCs之后肿瘤体积显著减小，肿瘤部位的MDSCs细胞的数量也明显减少，伴随着MDSCs的减少，肿瘤微环境中的CTL应答显著增强。（6）利用抗体或者吉西他滨剔除小鼠体内的MDSCs，或者使用趋化因子CXCR2受体拮抗剂抑制MDSCs到达肿瘤部位后，肿瘤微环境中IL-17的产生显著减少，不仅γδT细胞分泌的IL-17显著减少，Th17细胞分泌的IL-17也相应显著减少了。（7）MDSCs可以诱导γδT细胞分泌大量的IL-17，而利用IL-1β和IL-23的中和抗体以及IL-1R-/-小鼠，我们发现MDSCs诱导γδT细胞分泌IL-17的作用部分依赖于IL-1β和IL-23，而粒细胞样（Granulocytic） MDSCs具有更强的诱导产生IL-17的能力。（8）IL-17可以显著增强MDSCs对γδT细胞的诱导作用，而且这一增强效果具有剂量依赖性，当加入IL-17中和抗体后可以部分阻断这一过程，IL-17处理MDSCs后可以促进其分泌IL-1β和IL-23。结论：IL-17可以诱导肿瘤细胞分泌大量的CXCL5，通过CXCR2依赖的方式招募MDSCs到达肿瘤微环境，然后通过增强MDSCs的免疫抑制功能间接抑制CD8+T细胞的抗肿瘤应答。IL-17还可以增强MDSCs的抑制功能，也可以诱导MDSCs分泌IL-1β和IL-23，反过来促进IL-17的产生，这一正反馈机制可以在肿瘤微环境中形成一个高水平IL-17环境，促进和维持肿瘤的发生发展。