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目的:应激是日常生活中常见的外部影响因素,可导致生理及行为障碍,甚至影响饮食模式。而应激的反馈调节系统包括中枢和外周神经系统中各种反馈及相关肽类的调控。食欲素A(orexin-A,OXA)是下丘脑分泌的参与摄食的重要神经肽之一,与摄食及肥胖的发生有着密不可分的联系。有研究报道,出现慢性不可预知温和应激症状的雄性Wistar大鼠,其下丘脑外侧区(Lateral area of hypothalamus,LHA)内orexin能神经元的数量明显减少。此外,与健康人相比,长期受到心理疾病困扰的心境障碍及抑郁患者的脑脊液内OXA水平明显降低。下丘脑包含多个与摄食相关的重要核团,其与伺情绪中枢有着密切关联,如杏仁核就是其中之一。杏仁核是产生情绪、识别情绪和调节情绪的重要中枢,其包括中央杏仁核(central amygdala,Ce A)、基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)和基底内侧杏仁核(Basal medial amygdala,BMA)。Ce A与下丘脑之间有往返纤维联系,参与下丘脑摄食调控。本研究采用让动物在49天时间内接受慢性、不可预知的温和刺激,模拟人类日常生活中接受的慢性低强度应激,建立慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型大鼠,观察Ce A orexinA对慢性不可预知温和应激大鼠摄食行为、胃酸分泌、胃运动以及胃排空的影响及潜在机制。目的是为临床应激性心理障碍疾病导致胃肠功能紊乱的防治提供可靠实验依据。方法:(1)构建慢性不可预知温和应激大鼠模型:随机选择应激因素:大鼠24 h禁食,或禁水24 h,或24 h应用潮湿垫料,或4℃下强迫大鼠游泳5 min,或大鼠处于昼夜颠倒环境(8:00-20:00黑暗,20:00-8:00光照),或鼠笼倾斜45°角24 h。每天上午8:00~9:00,CUMS+NS组大鼠和CUMS+OXA组大鼠随机给予上述刺激之一,每种刺激每周仅给予1次。分别于1、3、5、7周应激刺激结束后测量大鼠体重。假慢性不可预知温和应激组大鼠不进行随机应激因素处理,其他条件与慢性不可预知温和应激组大鼠一致。49天后,若CUMS模型组大鼠的体重较Sham组大鼠降低超过30%则视为建模成功。(2)实验分组:选取Sprague Dawley(SD)雄性大鼠,随机分为4组:(1)正常大鼠生理盐水组(Sham+NS组):正常大鼠Ce A注射0.5μl NS;(2)慢性不可预知温和应激大鼠NS组(CUMS+NS组):慢性不可预知温和应激大鼠Ce A注射0.5μl NS;(3)正常大鼠orexin-A组(Sham+OXA组):正常大鼠Ce A注射2.0 n M/0.5μl OXA;(4)慢性不可预知温和应激大鼠orexin-A组(CUMS+OXA组):慢性不可预知温和应激大鼠Ce A注射2.0 n M/0.5μl OXA。(3)大鼠Ce A区置管,经套管向Ce A核团微量注射OXA,观察正常和慢性不可预知温和应激模型大鼠0-1h,1-2h,2-3h摄食量及3小时累计摄食量的变化情况;(4)Ce A核团微量注射OXA,采用幽门结扎法,观察正常和慢性不可预知温和应激模型大鼠胃酸分泌的改变;(5)大鼠胃窦浆膜层植入应力传感器,Ce A核团注射OXA,观察正常和慢性不可预知温和应激模型大鼠胃运动的改变;(6)Ce A核团微量注射OXA,观察对正常和心理应激模型大鼠胃排空的影响;(7)采用免疫组化染色方法,观察和比较慢性不可预知温和应激大鼠和健康大鼠Ce A内OX-1R免疫阳性细胞的表达;(8)采用western blot方法,观察和比较慢性不可预知温和应激大鼠和健康大鼠Ce A内OX-1R的蛋白表达;(9)采用放射性配体受体结合分析法(radioligand receptor binding assays,RBA),观察和比较慢性不可预知温和应激大鼠和健康大鼠Ce A内OXA与OX-1R的结合力变化。结果:(1)Ce A微量注射OXA对CUMS大鼠摄食量影响研究显示:与正常大鼠相比,CUMS大鼠0-1h,1-2h和2-3h的食物摄入量及3小时累积食物摄入量均显著降低(P<0.05),且第1小时摄食量减少更为显著(P<0.05)。与Sham+NS组相比,正常大鼠Ce A微量注射OXA,注药后0-1h(P<0.05),1-2h(P<0.05),2-3h(P<0.05)的食物摄入量和3小时累积食物摄入量(P<0.05)均显著增加,且第1小时摄食量增加更为显著(P<0.05)。与CUMS+NS组大鼠相比,CUMS大鼠Ce A微量注射OXA,注药后0-1h(P<0.05),1-2h(P<0.05),2-3h(P<0.05)的食物摄入量和3小时累积食物摄入量(P<0.05)均显著降低,且第1小时摄食量减少更为显著(P<0.05)。进一步统计学分析显示,与正常大鼠Ce A微量注射OXA相比,CUMS大鼠Ce A注射OXA所增加的第1小时摄食效应更为显著(P<0.05)。(2)Ce A微量注射OXA对CUMS大鼠胃酸分泌的影响结果显示:正常大鼠相比,CUMS大鼠胃酸分泌显著降低(P<0.05)。与Sham+NS组相比,正常大鼠Ce A微量注射OXA,胃酸分泌显著增加(P<0.05)。与CUMS+NS组大鼠相比,CUMS大鼠Ce A微量注射OXA,胃酸分泌显著回升(P<0.05)。进一步统计学分析显示,与正常大鼠Ce A注射OXA相比,CUMS大鼠Ce A微量注射OXA所增加的胃酸分泌更为显著(P<0.05)。(3)Ce A微量注射OXA对CUMS大鼠胃运动的影响结果显示:与正常大鼠相比,CUMS大鼠胃窦部移行性复合运动(MMC)Ⅲ期运动指数(MI%)显著降低(P<0.05)。与Sham+NS组大鼠相比,正常大鼠Ce A微量注射OXAⅢ期MI%显著升高(P<0.05)。与CUMS+NS组大鼠相比,CUMS大鼠Ce A微量注射OXA,Ⅲ期MI%显著回升(P<0.05)。统计学分析还发现,与Ce A微量注射OXA正常大鼠相比,CUMS大鼠Ce A微量注射OXA所增加的胃运动更为显著(P<0.05)。(4)Ce A微量注射OXA对CUMS大鼠胃排空的影响结果显示:与正常大鼠相比,CUMS大鼠胃排空率显著降低(P<0.05)。与Sham+NS组相比,正常大鼠Ce A微量注射OXA,大鼠胃排空率显著增加(P<0.05)。与CUMS+NS组大鼠相比,Ce A微量注射OXA,CUMS大鼠注药后胃排空率显著回升(P<0.05)。统计学分析还发现,与正常大鼠Ce A注射OXA相比,CUMS大鼠Ce A微量注射OXA所增加的胃排空作用更为显著(P<0.05)。(5)慢性不可预知温和应激对Ce A OX-1R免疫阳性神经元表达的影响结果显示:与正常大鼠相比,CUMS大鼠Ce A OX-1R免疫反应阳性神经元的表达明显增多(P<0.05)。(6)慢性不可预知温和应激对Ce A OX-1R蛋白表达的影响结果显示:与正常大鼠相比,CUMS大鼠Ce A内OX-1R蛋白表达明显增加(P<0.05)。(7)慢性不可预知温和应激对OX-1R与OXA配体亲和力的影响结果显示:与正常大鼠相比,CUMS大鼠Ce A内OX-1R与配体OXA特异性结合活性显著增高(P<0.05)。结论:慢性不可预知温和应激可使大鼠阶段性摄食量以及累计摄食量明显减少,尤其是急性摄食初期减少更为显著;同时慢性不可预知温和应激可使大鼠胃酸分泌、胃运动、以及胃排空率均显著降低或减弱;Ce A外源性Orexin-A可有效缓解大鼠慢性不可预知温和应激导致的以上负面效应,该作用可能与Ce A内OX-1R表达增加,或与Ce A内OX-1R与OXA结合力增强有关。