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第一章卵巢癌不同淋巴结转移潜能细胞分泌蛋白差异分析目的分析卵巢癌不同淋巴结转移潜能细胞分泌蛋白的改变,寻找与卵巢癌淋巴结定向转移密切相关的潜在的诊断性分子标志物以及治疗靶点。方法以卵巢癌细胞(SKOV3)、卵巢癌淋巴结定向高转移细胞(SKOV3-PM4)为研究对象,分别收集其培养的上清液,利用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)技术和相对与绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术筛选和鉴定差异表达的蛋白质,通过NCBInr数据库和Gene ontology、DAVID、String、IPAD、Core mine等生物学软件,对差异蛋白进行蛋白功能、定位、生物过程分析,初步筛选与卵巢癌淋巴结定向转移相关的节点蛋白。并采用蛋白质印迹法验证挑选目标蛋白在细胞分泌蛋白中的表达情况。结果1.二维凝胶电泳显示SKOV3细胞分泌蛋白质点数约为569±156,SKOV3-PM4细胞分泌蛋白质点数约为598±175。选取差异较大的七个差异蛋白点进行MS+MS/MS质谱鉴定,它们分别为乙二醛酶1(GL01)、翻译后调节肿瘤蛋白(TPTC)、二磷酸核苷激酶B(NDPK-B)、膜联蛋白(ANXA1)、热休克蛋白27(HSP)、过氧化物氧化还原蛋白(PRDX1)和磷脂酰乙醇胺结合蛋白Ⅰ(PEBP-Ⅰ)。2.iTRAQ技术鉴定出SKOV3细胞、SKOV3-PM4细胞的分泌蛋白均为200多种(置信度大于95%的蛋白点),SKOV3-PM4细胞与SKOV3细胞比较差异分泌蛋白共46种,其中表达上调的差异蛋白有30种；表达下调的差异蛋白有16种。3.差异蛋白主要涉及细胞内离子运输、物质代谢、应激反应、酶活性调节、DNA合成、转录和翻译等生物学过程。其中占前三位的依次为细胞内离子转运蛋白23%,能量代谢蛋白19%,酶活性调节蛋白14%。4.通过蛋白互作网络图分析确定SPARC、 ANXA2、TKT、ALDOA、A2M、CTSD、CTSDB、HP、CEACAMS、SERPINA1等与卵巢癌淋巴结转移相关的候选靶蛋白。5.挑选NDPK-B、ANXA1和HSP27蛋白经WB验证发现：SKOV3-PM4中ANXA1和HSP27表达高于SKOV3,而NDPK-B表达低于SKOV3细胞株。与质谱分析的结果基本一致。结论1.iTRAQ技术相比2-DE技术具有重复性好、灵敏度高、分离能力强,分析范围广等优点。2.在卵巢癌细胞与卵巢癌淋巴结定向高转移细胞之间的差异分泌蛋白涉及离子、能量物质运输、酶活性调节、转录翻译、蛋白质代谢等多种功能。3. SPARC、ALDOA、ANXA、A2M和TKT等分泌蛋白可能是卵巢癌淋巴结转移相关的调控蛋白,ANXA和HSP27有望成诊断或预测卵巢癌淋巴结转移患者血清检测的标志物。第二章淋巴管微环境诱导卵巢癌细胞上皮-间质转化的研究目的以人卵巢癌细胞(SKOV3)与卵巢癌淋巴结定向高转移细胞(SKOV3-PM4)和人淋巴管内皮细胞(HLEC)为研究对象,通过体外实验观察HLEC细胞微环境对卵巢癌细胞的上皮-间质转化(EMT)的影响。方法SKOV3细胞和SKOV3-PM4细胞分别与HLEC条件培养和共培养后做细胞爬片,采用免疫细胞化学染色方法检测转化生长因子(TGF-β1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)表达的变化。结果SKOV3细胞和SKOV3-PM4细胞经条件培养和共培养后TGF-p,和vimentin表达上调(P均<0.05), E-cadherin表达下调(P<0.05)。结论淋巴管内皮细胞微环境可促进卵巢癌细胞间质化的转变,增强卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力。第三章肿瘤微环境对肿瘤淋巴结转移的影响研究进展(文献综述)肿瘤微环境在肿瘤生长、浸润和转移过程中发挥着重要的作用,其主要由肿瘤细胞自身、肿瘤组织间的多种基质细胞分泌的细胞因子、趋化因子以及PH值、氧含量、常量和微量元素等组成。尤其是微环境中执行生物学功能的各种蛋白质分子,它们的分布、表达与肿瘤细胞的生长状态息息相关。因此研究肿瘤微环境与肿瘤浸润、转移过程存在的差异蛋白成为研究者们关注的重点。随着定量蛋白质组学技术的飞速发展,规模化蛋白质丰度数据的产出,对于揭示肿瘤发生转移的机制,发现肿瘤转移的生物标志物、抑制肿瘤转移的治疗靶点成为可能。