禽流感是由禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）引起的一种禽类急性传染病,世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）将高致病性禽流感定为必须报告的动物疫病。H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感,与其它病原混合感染时可以引起禽类高发病率和死亡率,H9N2AIV还可以感染许多哺乳动物,这对养禽业和公共卫生安全都造成了巨大的威胁,评估H9N2 AIV是否会引起流感大流行是保障全球公共卫生安全的首要任务。随着我国肉鸡市场需求的不断增加,家禽养殖业正逐步朝着规模化、集约化的方向发展。因此,大型养殖场的疾病流行病学调查对于疫病的监测具有重要意义。为了更全面掌握H9N2亚型AIV的发生发展规律,本研究对某大型肉鸡公司H9N2 AIV进行分离鉴定,并对分离株的HA基因和NA基因进行遗传进化分析,同时通过全基因组测序、小鼠致病性试验、反向遗传操作探究病毒的抗原性和致病性,以期了解H9N2亚型AIV的进化趋势和变异情况,对禽流感的防控提供理论依据。主要研究内容以及研究结果包括以下三个部分:1.2012年-2019年某大型肉鸡公司H9N2亚型禽流感病毒囊膜蛋白进化分析本研究对2012年-2019年某大型肉鸡公司疑似H9N2亚型禽流感患病或死亡的鸡进行H9N2亚型AIV的分离鉴定,并对分离株的HA和NA基因的遗传进化、抗原关键位点进行分析。结果显示,25株H9N2 AIV分离株HA、NA基因均属于h9.4.2.5分支,且序列间同源性均较高。HA分析发现,分离株受体结合左侧缘224-228位均为NGLMG,受体结合右侧缘呈现SKACS、STACS、SNTCS三种变化;25株分离株中的19株190位受体结合位点由A突变为T/V;24株在313位增加了一个潜在的糖基化位点NCS,23株在218位缺失了一个潜在的糖基化位点NRT,2株分离株在145位增加了一个潜在的糖基化位点NGT;NA分析发现,2株70位或143位增加了一个新的糖基化位点,2株在69位或86位缺失了糖基化位点;63-65位都缺失了 3个氨基酸残基TEI,呈现茎部缺失现象。这些结果提示,随着疫苗的应用,H9正在发生一些变异,这些变异对病毒特性影响如何还有待进一步探索。2.H9N2 AIV分离株的小鼠致病性试验由于H9N2 AIV极易与其它病原发生混合感染,本研究首先对H9N2 AIV分离株进行了病毒的空斑纯化,通过IFA初步验证和RT-PCR进一步验证,得到三株空斑纯化株:WJ356-14、JX191-1、2019326-19,并对三株病毒进行了全基因组测序。为了探究病毒对哺乳动物的致病性,我们进行了小鼠致病性试验。研究发现:三株病毒HA蛋白190位受体结合位点呈现A、V、T三种变化。WJ356-14的NA蛋白在143位增加了一个潜在的糖基化位点NHS;PB2蛋白在588位由A突变为V,627位由E突变为V。进行小鼠致病性试验发现,14d观察期内小鼠无明显的临床症状,但感染JX191-1病毒后能够明显地引起小鼠增重减缓,而且能引起小鼠肺脏较为严重的炎症反应。通过HI试验发现,感染JX191-1病毒的小鼠产生的HI抗体水平高于另外两组实验组。3.HA145糖基化位点对病毒生物学特性的影响在研究中发现分离到的 H9N2 AIV 毒株 A/chicken/Jiangxi/106/2012（H9N2）（JX106）的HA蛋白在145位氨基酸由S突变为N,使得在该处增加了一个潜在的糖基化位点NGT。本研究以JX106分离株为研究对象,通过反向遗传操作进行病毒拯救,通过病毒生长曲线测定、受体亲和力检测和小鼠致病性试验探究HA蛋白中145位糖基化位点对病毒复制、受体亲和力和致病性的影响。研究发现rgJX106-HA145N和rgJX106-HA145S两株病毒在A549细胞中的生长情况以及对鸡胚的感染力无明显差异。HA蛋白145位无糖基化位点的rgJX106-HA145S与α2,6-唾液酸受体的亲和力更佳。通过小鼠感染性实验,发现rgJX106-HA145S在第三天时肺部病毒含量更多,而且可引起小鼠更明显的减重,这些结果提示HA蛋白145位不存在糖基化位点的H9N2病毒对小鼠的致病力更强。采集小鼠血清测定血凝抑制效价,发现两株病毒不显著影响HI抗体的产生。交叉血凝抑制试验发现无糖基突变的rgJX106-HA145S具有更高的交叉HI效价。