前言：　　母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是最常见的婴幼儿颅外实体肿瘤，是一种胚胎期的交感神经节后肿瘤。大多起源于肾上腺，约占所有儿童肿瘤的8-10％，死亡率约15％，是目前儿科亟待解决的难题。该病具有自发转归、变形或侵袭行为的能力，预后很差。目前治疗高度恶性NB的方法包括化疗、手术和放疗。即使经过这些方法的综合治疗，能达到长期治愈的儿童不足40％。之后患者还要经历肿瘤复发及高剂量化疗后导致的并发症。因此亟需一种高效低毒的治疗方法，而以小分子为靶向的药物治疗则成为有潜力的代表。　　Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路是Wnt通路中研究最多的通路，也称为经典通路，是一个高度保守的通路，与人类出生缺陷、癌症和其他疾病等有关。在胚胎发育过程中，Wnt家族参与调节细胞增殖、细胞极性和细胞的命运，是最基本的转导机制之一。已有研究表明，Wnt信号通路的失调发生在几种类型的癌症中，包括结肠癌，肝癌及神经外胚层来源的脑肿瘤。Wnt/β-catenin信号通路的一个重要特征是转录助激活剂β-catenin的稳定性，它受由轴蛋白(Axin)、结直肠腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli，APC)易感基因的蛋白产物、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase3，GSK3)和酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)组成的降解复合物的调节。当Wnt刺激信号缺失时，β-catenin通过泛素化/蛋白激酶途径被磷酸化而降解。而当Wnt信号存在时，Axin介导的β-catenin的磷酸化被抑制，从而引起β-catenin在胞浆中累积并进入细胞核，与淋巴细胞强化因子（1ymphoid enhancing factor，LEF）或T细胞趋化因子(T cell factor，TCF)家族结合，激活Wnt通路的下游转录基因，如smad4、tsh、cyclin D1、c-myc等，致使细胞异常增殖，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。因此，抑制Wnt信号通路已成为一个引入瞩目的治疗癌症的策略。　　近年发表在Nature杂志的一项令人振奋的研究成果，连同更早的一项，已经证实一个新的小分子抑制剂XAV939能够在结肠癌细胞系中阻断Wnt信号通路，通过与端锚复合酶（tankyrase，TNKS）的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)催化区结合，引起Axin蛋白的稳定化，因此导致β-catenin降解增加。已有报道，作为TNKS家族的主要成员之一，tankyrasel(TNKS1)可在一些肿瘤中上调，包括多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、高度恶性非霍奇金氏淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌和膀胱癌等。这提示TNKS1在肿瘤进展中起到一定作用。　　端粒、端粒酶以及TNKS与人类“细胞老化”及“细胞永生化”有着重要而特殊的关系，这种相关性为老年病和肿瘤的研究带来了新的机遇。端粒(telomere)是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”样结构，能够维持染色体的完整。端粒酶是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于“反转录酶”。人类的端粒酶亚单位基因已被复制出来，分别是端粒酶RNA(hTR)、端粒酶结合蛋白(hTP1)和端粒酶活性催化单位(hTERT)。端粒酶的功能主要是维持端粒的长度。它能利用端粒3末端为引物，以自身RNA为模板合成端粒-TTAGGG-重复序列添加到染色体末端，从而维持端粒原有的长度。在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂克隆的细胞中，才可以检测到有活性的端粒酶。当细胞分化成熟后，端粒酶的活性就会逐渐消失。但在恶性肿瘤细胞中，端粒酶活性异常增高而使体细胞表现出无限增殖的特性。　　TNKS属于二磷酸腺苷核糖多聚合酶，有1和2两种。TNKS1定位于8号染色体p23.1，蛋白由1237个氨基酸残基组成。主要有4个结构域，从氨基端向羧基端依次为:1）HPS结构域;2）ANK结构域;3）SAM结构域;4）聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)结构域。因此TNKS1具有明确的PARP活性。但它并不能直接影响端粒酶的活性，而是通过使端粒结合蛋白TRF1核糖基化而丧失结合端粒DNA的能力，从而解除了TRF1对端粒结构的束缚作用，使端粒处于一种“开放”的结构状态，容易使端粒酶和其他因子接近端粒末端，催化端粒的延长，维持癌细胞端粒长度的稳定性，保证癌细胞持续生长增殖。因此，TNKS1是人体内端粒酶激活、端粒延长的正调控因子。常用的端粒酶抑制剂需要较长的治疗周期，肿瘤细胞容易产生耐药性，对具有端粒酶活性的正常组织，如骨髓、生殖系统等产生影响，因此治疗效果并不理想。　　2001年，Reya等首次提出肿瘤干细胞(Tumor stem cells，TSCs)理论。2006年美国癌症研究协会(American Association for Cancer Research)对TSCs给出的明确定义是:肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。TSCs理论认为，TSCs是肿瘤不断复发和转移的根源，只有完全消灭了TSCs，肿瘤才能被彻底治愈。TSCs理论的提出，为肿瘤研究提供了全新的视角，并逐渐成为研究热点和主流趋势。由于TSCs大多处于休眠状态，停滞于细胞周期中的G0期，且高表达三磷酸腺苷结合盒（ATP-binding cassette，ABC）家族膜转运蛋白及多药耐药蛋白(multidrug resistance protein，MDRP)，可将药物及毒性物质等运输到细胞外，因而对常规化疗药不敏感，是导致肿瘤化疗失败的主要原因。因此，分离和纯化出肿瘤中存在的TSCs，并将其作为靶点，利用小分子药物对其进行靶向杀伤，同时结合化疗药杀死肿瘤细胞的多靶点联合治疗策略被认为是肿瘤治疗的新模式，有望彻底根治肿瘤。　　本研究在检测到TNKS1在NB细胞系SH-SY5Y细胞高表达的基础上，采用XAV939处理细胞，检测细胞活力、细胞凋亡、细胞周期的改变，又采用RNAi的方法阻断TNKS1基因的表达，再检测细胞的克隆形成率、Wnt/β-catenin信号通路及抗凋亡蛋白、端粒长度、端粒酶活性、细胞凋亡等的细胞超微结构及侵袭能力的变化。探讨XAV939抑制细胞增殖及诱导其凋亡的机制。在此基础上，分选出NB干细胞，并用XAV939及RNAi-TNKS1处理，观察其超微结构、TSCs标志物的表达及迁移能力的改变，探究其对NB干细胞的自我更新能力，即“干性”(Stemness)的影响，为探索NB治疗的新靶点提供理论依据。　　材料与方法：　　1、RT-PCR检测SH-SY5Y细胞中TNKS1 mRNA的表达。　　2、MTT法检测不同浓度XAV939对细胞增殖活力的影响，并确定最佳使用浓度进行后续试验。　　3、Annexin V FITC法和Hoechst33342染色法检测XAV939处理后细胞凋亡的情况。　　4、流式细胞术检测XAV939处理后细胞周期的改变。　　5、用RNAi的方法阻断TNKS1基因的表达，并用Real-Time PCR检测干扰效果，确定最佳干扰序列进行后续试验。　　6、XAV939处理和RNAi-TNKS1后，用体外克隆形成实验检测SH-SY5Y细胞克隆形成能力的改变，用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路及抗凋亡蛋白Bcl-2的变化。　　7、XAV939处理和RNAi-TNKS1后，用Real-Time PCR法检测端粒长度的改变，TRAP-ELISA法检测端粒酶活性的变化，透射电镜观察细胞凋亡的超微结构，Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。　　8、分别用Hoechst33342染色法分选SP细胞和CD133抗体染色法分选阳性细胞，并确定最佳的TSCs的分选方法。　　9、用不同浓度Etoposide处理的方法富集NB干细胞，分选后扩增培养，并用电镜观察其超微结构。　　10、将培养扩增的NB干细胞用XAV939和RNAi-TNKS1处理后，用Real-TimePCR检测NB干细胞中CD133mRNA的表达，Western blot检测其CD133蛋白的表达，免疫荧光检测其CD133蛋白的亚细胞定位表达，Transwell法检测NB干细胞的迁移能力。　　结果：　　1、RT-PCR结果显示，与海马神经元细胞系HT-22相比，SH-SY5Y细胞高表达TNKS1 mRNA。　　2、MTT结果显示，1μM XAV939作用24h后，SH-SY5Y细胞的增殖活力有明显下降，到72h时下降达最大值。当浓度为1，5，10和50μM，时间为24h，48h和72h时，这种抗增殖作用呈剂量和时间依赖性。后续试验均采用1μM XAV939进行干预。　　3、Annexin V/FITC法和HoechSt33342染色法的结果均显示，SH-SY5Y细胞经XAV939处理24h后没有明显的凋亡，而处理48h或72h后，实验组凋亡率明显高于对照组，且随着时间的增加而增加。　　4、细胞周期的结果显示，XAV939处理后24h、48h及72h，处于G0/G1期的细胞减少，而G2/M期及S期的细胞增多。　　5、慢病毒转染结果显示，当培养基为完全培养基+5ug/ml polybrene，MOI值为10时，细胞转染率达到80％左右，状态较佳。Real-Time PCR检测干扰效果显示，＃3 shRNA的干扰率达60％左右，效果最佳。　　6、Western blot结果显示，通过XAV939处理或RNAi-TNKS1后可减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;此外，Wnt/β-catenin通路的枢纽蛋白β-catenin及其下游靶蛋白Cyelin D1和c-Myc的表达也降低。　　7、Real-Time PCR结果显示，XAV939处理和RNAi-TNKS1后，端粒长度均较对照组缩短，但端粒酶活性没有明显变化，透射电镜可观察到线粒体明显肿胀，形成空泡，染色质凝聚等典型的凋亡或坏死形态，细胞侵袭能力有不同程度的降低。　　8、流式细胞仪分析的结果显示，Hoechst33342染色法分选的SP细胞比率约为0.8％，但SP细胞群不明显，特异性差，且染料对细胞损伤大。CD133抗体染色法分选的阳性细胞比率约为0.78％，该方法特异性较强，对细胞损伤小，步骤简单，因此后续研究采用该方法进行。　　9、流式细胞仪分析结果显示，60μM Etoposide处理后CD133阳性细胞的比率最高，因此用该浓度的Etoposide进行NB干细胞的富集。扫描电镜可见，CD133阳性细胞呈圆形或卵圆形，突起细小，表面有丰富的微绒毛并聚集成球生长，表明其处于未分化状态;透射电镜显示，CD133阳性细胞核-质比高，细胞器不发达，处于原始幼稚阶段。　　10、XAV939处理和RNAi-TNKS1后，Real-Time PCR结果显示，NB干细胞的CD133mRNA表达降低，Western blot结果显示CD133蛋白表达降低，免疫荧光结果显示CD133蛋白在细胞内表达的平均荧光强度降低，Transwell结果显示NB干细胞的迁移能力下降。　　结论：　　1、TNKS1 mRNA在NB细胞系SH-SY5Y细胞中的表达升高。　　2、XAV939可抑制SH-SY5Y细胞增殖，诱导其凋亡，使细胞停滞在G2/M期及S期。　　3、XAV939处理和RNAi-TNKS1均可诱导SH-SY5Y细胞凋亡，降低其体外克隆形成率和侵袭能力，使端粒长度缩短，但端粒酶活性并无明显变化，提示其发挥作用的机制不是直接抑制端粒酶，而是通过抑制TNKS1进而抑制Wnt/β-catenin信号通路所致。　　4、Hoechst33342染色法适用于无明显表面标志的TSCs的分选，而CD133抗体染色法适用于NB干细胞的分选。用化疗药Etoposide处理的方法可富集NB干细胞，简单易行，成本较低。　　5、XAV939处理和RNAi-TNKS1均可使NB干细胞的CD133mRNA及蛋白表达降低，迁移能力下降，说明可抑制NB干细胞的生长，为靶向清除TSCs治疗NB提供实验基础。