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细菌素是乳酸菌产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽,有作为安全高效食品防腐剂的良好应用前景。本试验对以往从发酵食品中分离出的一株乳酸菌进行了鉴定,用生理生化试验确认其为乳酸片球菌,并发现该菌株具有杀死单核细胞增多症李氏杆菌的作用。经蛋白水解酶试验、对过氧化氢酶试验、有机酸排除试验等认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽,即细菌素。根据GenBank(X95976)公布发表的Pediococcus acid 16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异引物,采用PCR技术,扩增出16SrRNA片段,并将该片段定向克隆于克隆测序pUCm-T载体上。经PCR、限制性内切酶酶切验证筛选,最后对阳性的转化子提取质粒进行DNA序列的测定与分析,同源性为99%,进一步从基因分子水平鉴定了分离株为乳酸片球菌。为了探索乳酸片球菌的抗菌机理,从分子水平检测是否有片球菌素操纵子的存在,本试验根据GenBank(Accession number M83924)公布发表的Pediococcus acid结构基因序列,设计合成了3对特异引物,采用PCR技术,扩增出目的片断,并将片段定向克隆于克隆测序pTA2载体上。经PCR、限制性内切酶酶切验证筛选,最后对鉴定为阳性的转化子提取质粒进行DNA序列的测定与分析,发现该乳酸片球菌素操纵子大小为5595bp,含有4个主要的基因,分别是PedA、PedB、PedC、和PedD基因,与GenBank发表的乳酸片球菌操纵子基因相比同源性达到99.9%,在第1688个碱基变异,导致PedC基因一个氨基酸的改变,这就从分子水平说明了该菌抗菌活性是由操纵子基因编码实现的。经试验发现,我们分离的乳酸片球菌细菌素产量较低,不适合进行产业化开发。本试验提取乳酸片球菌的全基因组作为模版,根据GenBank(M83924)发布的pediocin PA-1结构基因序列设计合成一对特异引物,采用PCR技术,从基因组DNA中扩增出目的片段,并将该片段定向克隆于克隆测序载体上。经验证筛选,最后对鉴定为阳性的转化子进行核苷酸序列测定与分析,然后克隆到表达载体pET-28a,转化E.coliDH5α,经过kana+平皿筛选,质粒酶切,PCR两步验证,获得阳性重组质粒,并转化表达宿主菌E.coli BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳,显示在4600Da左右出现条带,与已预期的细菌素分子量大小符合。