近年来,糖尿病的发病率明显上升,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)作为一个独立于冠心病、心脏瓣膜病、高血压病性心脏病的临床疾病,主要表现为心肌收缩和舒张功能异常。目前DCM的发病机制较为复杂,主要与心肌能量代谢紊乱、炎症、氧化应激、钙离子超载、细胞凋亡有关,而其主要的病理表现为心肌细胞肥大、细胞外基质沉积、心室质量/体质量(心重指数)增加、心肌间质重构及心肌纤维化。Firodaliso等研究表明,链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠早期(3天)即可出现心肌细胞凋亡现象,因此认为氧化应激、心肌细胞凋亡、心肌纤维化可能在DCM心室重塑及心力衰竭中起着十分重要的作用。和细胞增殖一样,细胞凋亡也是受基因调控的精确过程。目前细胞凋亡的途径主要有两条,一是通过细胞膜上的死亡受体激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase),而另一条途径是通过细胞质内的线粒体途径释放细胞因子,细胞因子可激活caspase,降解细胞内的重要蛋白质,从而诱导细胞凋亡。因此,caspase-3作为细胞凋亡的标志物,在各种因素启动的凋亡程序中发挥着关键的调控作用,是参与凋亡的caspase级联反应的最终效应因子,抑制caspase-3的活性或功能可抑制细胞凋亡。AKT也称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),可诱导相关转录因子的磷酸化,通过上调抗凋亡基因和下调凋亡基因的表达,从而实现对细胞凋亡的抑制,促进细胞存活。在新发现的抗凋亡蛋白家族中,X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)蛋白是目前已知最强的凋亡抑制因子,可直接抑制caspase从而的保护细胞免受各种凋亡刺激。而AKT能够磷酸化XIAP的Ser87位点,使其免于被泛素化及降解,稳定在细胞内的表达,起到抑制凋亡作用。衔接蛋白p66shc可参与细胞内氧化应激信号的转导,调控细胞内线粒体活性氧ROS的产生并介导细胞凋亡。诸多研究表明,p66shc参与了心血管疾病、糖尿病等疾病的发生、发展。另外,p66shc的磷酸化是由体内PKCβ的激活调节的。PKCβ/p66shc信号通路参与小肠缺血再灌注损伤介导的多脏器损伤的病理生理过程。卡维地洛作为第三代β-受体阻滞剂,既能阻滞β1、β2受体,还能阻滞α1受体,同时具有抗氧化、清除氧自由基、减轻心室重构、抑制心肌纤维化、抑制细胞凋亡的作用。卡维地洛对糖尿病心肌病患者可能具有保护作用,其具体机制尚未完全阐明,可能与细胞内多个信号转导通路有关。为证明该假设,本研究1)临床观察卡维地洛对糖尿病心肌病患者的疗效;2)应用糖尿病心肌病大鼠动物模型,和体外高糖诱导的H9C2心肌细胞模型,观察卡维地洛对心肌炎症反应、细胞凋亡、胶原代谢、AKT/XIAP信号通路及PKCβ/p66shc线粒体氧化应激信号通路等的影响,为治疗糖尿病心肌病提供新的理论基础和实验依据。第一部分卡维地洛对糖尿病心肌病患者代谢、炎症反应及心功能的影响目的:卡维地洛对糖尿病心肌病患者心功能的影响及机制方法:选择2014年9月至2016年9月于唐山市工人医院心内科及内分泌科收治的糖尿病心肌病患者共90例,均符合诊断标准,其中男性50例,女性40例,年龄35-65岁,平均年龄45.6岁,采用简单随机化方法随机分为卡维地洛治疗组(n=50例)和对照组(n=40例)。对照组采用常规治疗,卡维地洛治疗组在对照组用药的基础上加用卡维地洛(达力全,罗氏制药)3.125 mg2/日口服2周,2周后如果无明显的心衰加重表现,改为6.25 mg2/日口服,继续口服2周,如仍无心衰加重表现,再继续口服8周。两组在开始治疗前及治疗后12周,应用ELISA法分别检测血清hsCRP、TNF-α、NT-proBNP(N-terminalpro-B-type natriuretic peptide,氨基末端B型脑钠肽前体)、空腹血糖、总胆固醇及甘油三酯水平,应用心脏超声检测左室舒张末期(LVEDd)及收缩末期内径(LVEDs)、左室射血分数(LVEF),通过6分钟步行距离实验来评定患者的运动耐力。结果:1生化指标的改变:两组治疗前后相比:空腹血糖、总胆固醇及甘油三酯水平无显著差异(P>0.05),且卡维地洛治疗12周后,治疗组与对照组相比上述生化指标仍无显著差异(P>0.05)。2心脏功能的变化:两组治疗后左室舒张末期内径、收缩末期内径、NT-proBNP水平均较治疗前明显减低(P<0.05),且治疗组与对照组相比减低更显著(P<0.05);两组左室射血分数均较治疗前显著升高(P<0.05),且治疗组与对照组相比升高更明显(P<0.05)。卡维地洛治疗组6分钟步行距离(577.40±80.13)m,较治疗前(292.95±34.12)m有所改善(P<0.05),与对照组(456.32±30.09)m相比有显著差异(P<0.05),对照组自身治疗前后对比6分钟步行距离也有显著差异(296.68±21.79)m vs(456.32±30.09)m(P<0.05)。3炎症指标的改变:两组治疗前后相比血清hsCRP、TNF-α水平明显减低(p<0.05),且治疗组与对照组相比减低更显著(P<0.05);结论:卡维地洛应用于糖尿病心肌病患者可以显著改善患者心脏收缩与舒张功能,提高患者的活动耐量,不影响患者血糖及血脂水平,其治疗作用可能与卡维地洛能够减轻心肌炎症反应及氧化应激、抑制心室重构及细胞凋亡、减轻心肌纤维化有关;第二部分AKT/XIAP信号转导通路在糖尿病心肌病大鼠心肌病变中的表达及卡维地洛的干预研究目的:研究卡维地洛对糖尿病心肌病大鼠AKT/XIAP信号转导通路的影响。方法:采用成年雄性WistarSD大鼠,通过高脂高糖饲料喂养联合腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)的方法,制成2型糖尿病心肌病大鼠模型。12周后分成低剂量卡维地洛组(lmg/kg/d)、高剂量卡维地洛组(10mg/kg/d),应用上述药物每天给大鼠灌胃一次,健康对照组及模型组每天给予相同剂量的生理盐水灌胃,连续给药12周后,处死取材。超声心动图检测左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVEDs)、左室射血分数(LVEF)。通过应用光学显微镜及电子显微镜分别观察健康对照组、糖尿病组大鼠心脏的组织形态学改变,从而确定糖尿病心肌病模型建立情况以及心肌炎症浸润程度;通过生化法检测血清IL-1β、TNF-α、空腹血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及NT-proBNP的含量以确定心肌的炎症反应及代谢、心功能方面的改变;用TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况;用Masson及Vimentin染色了解心肌纤维化情况;应用免疫组化方法检测caspase-3的表达;应用Western bolt技术检测AKT、p-AKT、XIAP、p-XIAP、caspase-3 及Ⅰ型胶原蛋白(Collgen Ⅰ)的表达。体外培养H9C2心肌细胞,分为正常对照组(NC,5.5mmol/LD-葡萄糖),高糖组(HG,33mmol/L D-葡萄糖),高糖+卡维地洛组(HG+Carv,33mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L卡维地洛),应用Western bolt技术检测AKT、p-AKT、XIAP、p-XIAP、IL-1β、TNF-α、CollgenI 及 caspase-3 蛋白的表达。结果:1大鼠的一般情况比较:健康对照组(NC组)大鼠毛发光泽,精神状态、进食水情况及活动度均较好,糖尿病模型组(DM组)大鼠通过高糖高脂饮食的喂养体重明显增加,喂养到4周时,体重已明显高于对照组。4周时给予腹腔内一次性注射链脲佐菌素(STZ),给药2周后,DM组大鼠体重开始下降,但在实验结束时仍明显高于Control组,但卡维地洛(Carv)治疗组大鼠体重较DM组显著增加(P<0.05),但仍明显低于NC高剂量卡维地洛(CarvH)组较低剂量组(CarvL)相比无显著差异(P>0.05);DM组大鼠应用STZ后1周即出现多饮多食、多尿的症状,并且逐渐加重,同时出现毛发变得灰黄、精神萎靡、活动度差的表现。Carv组与DM组相比上述症状无明显改善;DM组大鼠心脏质量/体质量(HW/BW)明显高于NC组(P<0.05),Carv治疗组与DM组相比(HW/BW)明显减低(P<0.05),且CarvH组与CarvL组相比差异更明显(P<0.05)。2大鼠的心肌组织病理学改变:电镜观察:NC组心肌细胞肌节结构(明带、暗带、Z线、M线)清晰可见,细胞连接闰盘结构清楚,肌束间线粒体纵行排列且膜结构完整;DM组部分肌丝、肌节溶解、断裂,闰盘间隙消失,线粒体肿胀、部分消失、部分固缩,心肌间质胶原沉积、毛细血管内皮肿胀;Carv组心肌组织改变介于DM组和NC组之间,心肌病变较DM组明显减轻,间质胶原沉积较少,毛细血管基底膜增厚减轻。HE染色:切片上可见DM组大鼠心肌细胞肥大且不规则、细胞排列紊乱、心肌细胞间质及细胞外基质增多、成纤维细胞增多;NC组:大鼠心肌细胞排列整齐、可见少量成纤维细胞、结构清晰;Carv组心肌细胞较DM组排列更规则,肌纤维变性较轻,纤维组织增生明显减少。通过电镜及HE染色观察DM组大鼠糖尿病心肌病模型成功建立。3大鼠心功能的改变:实验末,与NC组相比,DM组大鼠左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)均明显增加(P<0.05),EF值明显下降(P<0.05);而Carv低、高剂量预处理后LVIDd、LVIDs均明显降低(P<0.05),EF值明显升高(P<0.05),差异显著;Carv高剂量组与低剂量组相比LVIDd、LVIDs数值均有所减低,EF有所升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,DM组大鼠血浆NT-proBNP水平较显著升高(P<0.05);Carv低、高剂量预处理后血浆NT-proBNP水平明显下降(P<0.05)且Carv高剂量与低剂量相比血浆NT-proBNP水平下降更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。4生化指标的改变:与NC组相比,DM组大鼠IL-1β、TNF-α表达水平均增加(P<0.05)而予以Carv低、高剂量预处理后,治疗组上述两种指标表达水平均明显减低(P<0.05),且高剂量组减低更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比,DM组大鼠空腹血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平均明显升高(P<0.05)。但Carv低、高剂量组与DM组三组空腹血糖、TG、TC水平无显著差别,差异无统计学意义(P>0.05)。5大鼠心肌细胞凋亡的改变:正常心肌细胞核呈蓝色,TUNEL染色凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色,在光镜下计数5个高倍视野中凋亡阳性心肌细胞核数目及占总细胞核数目的比例,求其均值得出细胞凋亡阳性指数AI(Apoptosis Index)。与NC组相比,DM组AI数值明显升高,Carv低、高剂量组与DM组相比AI数值均明显下降且Carv高剂量组较Carv低剂量组相比下降更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western Bolt结果显示:与NC组相比,DM组大鼠caspase-3蛋白的表达水平明显升高,Carv低、高剂量药物干预后caspase-3蛋白表达水平明显下降,,且Carv高剂量组较Carv低剂量组下降更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化显示:caspase-3以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应,阴性对照除细胞核染成蓝色外,胞浆内无棕黄色反应物。与NC组相比,DM组大鼠阳性染色光密度积分明显增高,Carv低、高剂量药物干预后caspase-3阳性染色细胞数明显下降,且Carv高剂量组较Carv低剂量组下降更明显,差异均具有统计学意义(p<0.05)。6大鼠心肌组织胶原的变化:Masson染色结果:NC组大鼠心肌细胞之间、血管周围有少量胶原纤维;DM组大鼠心肌间质胶原纤维增生明显、排列紊乱、微血管纤维化明显,胶原纤维呈红色分布不均、相互连接成网状;Carv低、高剂量预处理后大鼠心肌胶原纤维增生均明显减轻,且Carv高剂量组胶原纤维增生减轻更明显,更接近于NC组。Masson染色心肌胶原分数(CVF1):与NC组相比,DM组CVF1数值明显升高,Carv低、高剂量预处理后CVF1数值明显下降,且Carv高剂量组与低剂量组相比CVF1数值下降更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Vimentin染色及Western Blot结果显示:与NC组相比,DM组大鼠I型胶原蛋白的表达较NC组明显增加(P<0.05),I型胶原容积分数(CVF)数值明显升高,Carv干预后I型胶原蛋白的表达明显下降,CVF也明显减低,且Carv高剂量组较低剂量组下降更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。7 Western Bolt结果显示:与NC组相比p-AKT、p-XIAP蛋白在DM组中表达明显下降(P<0.05),Carv干预后上述两者水平明显升高(P<0.05),且Carv高剂量组较低剂量组升高更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。但是AKT及XIAP水平在四组的表达无显著差异(P>0.05)。8 Western Bolt结果显示:与NC组相比,HG组H9C2心肌细胞caspase-3、TNF-a、I型胶原蛋白及IL-1β的表达水平均明显升高(P<0.05),Carv药物干预后上述蛋白的表达水平均明显下降(P<0.05);与NC组相比,p-AKT、p-XIAP蛋白在HG组中表达明显下降,Carv药物干预后上述两者的表达水平均明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。但是AKT及XIAP水平在三组的表达无显著差异(P>0.05)。其结果与体内模型的结果相似。结论:卡维地洛能够促进AKT及XIAP的磷酸化,减轻糖尿病心肌病大鼠心肌细胞炎症反应、抑制心肌细胞凋亡及心肌纤维化、改善心脏功能。第三部分PKCβ/P66shc氧化应激信号转导通路在糖尿病心肌病大鼠心肌病变中的表达及卡维地洛的干预研究目的:研究卡维地洛对糖尿病心肌病大鼠PKCβ/p66shc线粒体氧化应激信号转导通路的影响。、方法:大鼠血浆丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸反应物显色分光光度比色法。超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶反应显色分光光度比色法测定;应用Western bolt技术检测大鼠心肌p-PKCβ 1、PKCβ1、p-PKCβ2、PKCβ2、p-p66shc、p66shc、caspase-3 蛋白的表达。体外高糖环境培养H9C2心肌细胞,模拟体内模型,同第二部分,应用Western bolt 技术检测 p-PKCβ 1、PKCβ1、p-PKCβ2、PKCβ2、p-p66shc、p66shc及caspase-3蛋白的表达,应用激光共聚焦技术检测线粒体活性氧簇(ROS)的表达水平以及p-p66shc在线粒体内的转位率。结果:1大鼠症状体征、生化指标的改变:HE染色、Masson染色、电镜对超微结构改变的观察均同第二部分。2丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)检测结果:体内实验结果表明,与NC组相比,DM组大鼠MDA水平明显升高,SOD水平明显减低(P<0.05);与DM组相比卡维地洛治疗后MDA水平明显降低、SOD水平显著升高(P<0.05),且CarvH与CarvL组相比上述改变更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。体外高糖环境培养H9C2心肌细胞的结果与体内实验结果相一致。3 Western bolt 显示:与 NC 组相比,DM 大鼠 p-PKCβ2、p-p66shc 及caspase-3蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),Carv低、高剂量预处理后上述指标均明显下降(P<0.05),且Carv高剂量组较低剂量组下降更明显,差异均具有统计学意义(P<0.05)。但是p-PKCβ1、PKCβ1水平在四组的表达无显著差异(P>0.05)。体外高糖环境培养H9C2心肌细胞的结果与体内实验结果相似。4体外实验结果:激光共聚焦结果显示与NC组相比,HG组线粒体ROS生成显著增加,p-P66shc线粒体转位率明显增加(P<0.05),然而卡维地洛干预后H9C2心肌细胞线粒体ROS生成显著减低,p-P66shc线粒体转位率明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:卡维地洛能够抑制糖尿病心肌病大鼠PKCβ2/P66shc信号通路的激活,从而减轻糖尿病心肌病大鼠的氧化应激以及心肌组织胶原的沉积以及纤维化程度,减轻细胞凋亡,起到保护糖尿病心肌病的作用。