【摘 要】
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冷诱导RNA结合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein,CIRP）是在哺乳动物细胞中被发现的第一种冷应激或冷休克蛋白,伴随着冷应激过程过量表达。这一发现拉开了研究CIRP及其生物学功能的序幕。目前,科学家们已经证实CIRP不仅具有介导冷诱导的细胞生长抑制作用,而且可能参与人和动物的生殖发育、神经发育与调节、胚胎发育、肿瘤发生以及动物冬眠等生理学过程。因此,建立科
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冷诱导RNA结合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein,CIRP）是在哺乳动物细胞中被发现的第一种冷应激或冷休克蛋白,伴随着冷应激过程过量表达。这一发现拉开了研究CIRP及其生物学功能的序幕。目前,科学家们已经证实CIRP不仅具有介导冷诱导的细胞生长抑制作用,而且可能参与人和动物的生殖发育、神经发育与调节、胚胎发育、肿瘤发生以及动物冬眠等生理学过程。因此,建立科学的实验动物模型和制备CIRP抗体是深入研究CIRP生物学功能及开发其应用价值的实践基础。本研究以活体BALB/C鼠为研究对象,进行冷处理实验,首次分别从4℃处理8h和室温饲养的小鼠睾丸组织中提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增CIRP的cDNA,构建重组克隆质粒pGEM-T-CIRP,经PCR、酶切鉴定成功连接后,送测序公司测序,序列分析结果表明BALB/C鼠CIRP的cDNA被正确克隆;将克隆的cDNA转接入表达载体pQE-30 Xa,并转化至E.coli,XL-1 blue感受态细胞内,通过酶切鉴定筛选出阳性重组菌;经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot检测CIRP表达,同时优化IPTG诱导浓度,经Bandscan软件分析目的蛋白在菌体总蛋白中的含量,验证重组蛋白的表达形式,结果表明重组CIRP获得了正确表达,分子量约为21.89kDa,且存在于菌体裂解沉淀中,为不可溶性表达;在33℃、IPTG浓度为0.2mM时,诱导6h后,表达量较高,约占菌体总蛋白的18%;表达的目的蛋白经透析袋电洗脱法纯化后,对家兔进行常规免疫,应用间接ELISA检测到效价（在1∶12800到1∶25600之间）较高的多克隆抗体,表明此重组蛋白具有良好的抗原性。最后,通过Western-blot检测CIRP在重组菌和冷处理小鼠睾丸、肝脏中的表达,结果显示在约21.89kDa处可见一条清晰的特异性条带,在约18kDa处可见两条清晰的特异性条带,进而证实所制备的多克隆抗体能够与重组CIRP和天然CIRP发生特异性结合,可以作为生物试剂用于深入开展CIRP的功能性研究和应用性研究。本研究为研究活体动物体内CIRP的表达建立了实验模型;为开展CIRP的功能性研究提供了技术支持;为重组CIRP的应用奠定了物质基础。
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