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[目的]1.建立高效制备人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的方法,分离、扩增及鉴定hUCMSCs。以便为后续实验提供材料。2.分别构建细胞与动物放射性肺损伤(RILI)模型,为hUCMSCs临床治疗RILI提供理论依据和方法。3.初步探讨miR-29b介导hUCMSCs治疗RILI的作用机制。[方法]1.hUCMSCs的制备由中国人民解放军联勤保障部队第九二O医院临床实验科提供第3代hUCMSCs,倒置相差显微镜观察细胞生长特性,CCK-8检测hUCMSCs生长趋势,流式细胞术检测hUCMSCs表面抗原CD73、CD90、CD105、CD19和CD45的阳性表达率,hUCMSCs成脂、成骨、成软骨定向诱导分化并分析其分化潜能。2.RILI模型建立(1)细胞模型:人肺上皮BEAS-2B细胞进行总剂量8Gy照射,照射时视野覆盖全部细胞。造模成功后,细胞继续培养48h用于后续实验。(2)动物模型:将20只6-7周龄,体重19-21g的C57BL/6雌性小鼠经4%水合氯醛溶液以0.03ml/g的剂量进行腹腔注射麻醉,随后进行全肺16GY照射。造模成功后,分别在第35d、第70d处死小鼠并采集相关标本。3.hUCMSCs治疗RILI(1)hUCMSCs治疗细胞RILI模型:按上述方法制作细胞RILI模型成功后,采用transwell 6孔板间接共培养人肺上皮BEAS-2B细胞与hUCMSCs。将细胞实验分为4组:①正常BEAS-2B组、②BEAS-2B+hUCMSCs 组、③8GY-BEAS-2B 组、④8GY-BEAS-2B+hUCMSCs 组。各组细胞共培养48h后,将下室各组BEAS-2B细胞经0.25%trypsin-EDTA消化用于后续实验。(2)hUCMSCs治疗动物RILI模型:按上述方法制作动物RILI模型成功后,将20只小鼠随机分2组:①照射组10只;②hUCMSCs治疗组10只。照射后6h内,hUCMSCs治疗组小鼠经尾静脉注入第5代hUCMSCs悬液100ul(细胞浓度1.5×106个/ml);照射组小鼠经尾静脉注入等剂量的生理盐水。随后照射组和hUCMSCs治疗组每组随机选择3只小鼠,于造模后第35d及70d处死小鼠取材。(3)观察指标:细胞RILI模型:①光镜下各组BEAS-2B细胞形态学分析;②CCK-8检测各组生长增殖能力;③免疫组化检测各组BEAS-2B细胞中TGF-P1的表达;④RT-qPCR检测各组BEAS-2B细胞中纤维化生长因子Fibronectin、Collagen type Ⅰ的表达量;⑤Western Blot检测各组纤维化生长因子Fibronectin、Collagen type Ⅰ的表达量。动物RILI模型:①各组小鼠一般情况分析;②小鼠肺组织病理染色;③小鼠肺组织胶原纤维染色;④ELISA技术检测小鼠血清炎性相关细胞因子TGF-β1表达;⑤RT-qPCR检测小鼠肺组织中纤维化生长因子Fibronectin以及Collagen type Ⅰ的表达量。4.hUCMSCs对RILI的作用机制分析(1)细胞RILI模型:①RT-qPCR检测细胞各组中miR-29b的表达量;②RT-qPCR检测细胞各组中FSTL1和SPARC的表达量。(2)动物RILI模型:①RT-qPCR检测35d和70d各组小鼠肺组织中miR-29b以及FSTL1、SPARC的表达量;②明确miR-29b调节下游靶标基因 FSTL1 和 SPARC。[结果]1.hUCMSCs的鉴定第5代hUCMSCs呈纤维涡旋状、贴壁生长。生长增殖的潜伏期约为1d,对数增殖期为2-5d,5-7d后进入平台期。hUCMSCs的CD73、CD90、CD105、CD19 和 CD45 抗体阳性率分别为 100%、98.8%、97.8%、5.44%、0.00%。hUCMSCs可被诱导分化成类脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2.hUCMSCs对RILI的疗效(1)hUCMSCs治疗细胞RILI疗效:①光镜显微镜下8GY-BEAS-2B+hUCMSCs组的细胞形态较8GY-BEAS-2B组发生明显变化。②CCK-8实验显示BEAS-2B+hUCMSCs组较正常BEAS-2B组、8GY-BEAS-2B+hUCMSCs组较8GY-BEAS-2B组增殖速度明显加快(P<0.05)。③免疫组化检测结果显示8GY-BEAS-2B+hUCMSCs组较8GY-BEAS-2B组中TGF-β1表达减少(P<0.05)。④WB结果及RT-qPCR结果提示纤维化生长因子 Fibronectin 和 Collagen type I 的表达量在 BEAS-2B+hUCMSCs 组以及8GY-BEAS-2B+hUCMSCs 组中明显减少(P<0.05)。(2)hUCMSCs 治疗动物RILI疗效:①hUCMSCs移植35d后肉眼所见放射组小鼠背部毛发较治疗组光泽度差,颜色变浅。70d后,放射组小鼠背部毛发颜色变化较35d更为明显且解剖小鼠后发现放射组小鼠肺组织色泽较治疗组小鼠肺组织浅并可见散在白色结节。②无论是35d还是70d小鼠,经hUCMSCs治疗后的小鼠较放射组小鼠肺组织炎症程度及蓝色胶原染色纤维化程度减轻。③ELISA结果提示,TGF-β1的浓度在35d及70d治疗组小鼠肺组织中均有下降(P<0.05)。④RT-qPCR结果提示纤维化生长因子Fibronectin在35d和70d小鼠肺组织中表达量在治疗组中明显减少(P<0.05)。而纤维化生长因子Collagen type I在70d小鼠肺组织中表达量在治疗组中明显减少(P<0.05)。3.hUCMSCs对RILI的作用机制分析(1)细胞RILI模型:RT-qPCR结果显示BEAS-2B+hUCMSCs 组较正常 BEAS-2B 组、8GY-BEAS-2B+hUCMSCs 组较 8GY-BEAS-2B 组 miR-29b 的表达量上升(P<0.05)、FSTL1 和 SPARC 的表达量均下降(P<0.05)。(2)动物RILI模型:①RT-qPCR结果显示35d以及70d小鼠中miR-29b的表达量上升(P<0.05);而35d小鼠的FSTL1和70d小鼠的SPARC表达量均下降(P<0.05)。②根据TargetScan生物信息学数据库以及荧光素酶报告提示miR-29b可调节下游靶标基因FSTL1和SPARC(P<0.05)。[结论]1.第3代hUCMSCs贴壁生长,呈纤维旋涡状。高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD19和CD45,并具有向脂质、成骨、成软骨细胞分化的潜能,符合间充质干细胞的生物学特性,可用于间充质干细胞治疗。2.在细胞 RILI 模型中,8GY-BEAS-2B+hUCMSCs 组较 8GY-BEAS-2B 组纤维化程度降低;而在动物RILI模型中,无论是35d小鼠还是70d小鼠,治疗组较放射组肺损伤程度减少。以上两种模型提示hUCMSCs对RILI的治疗有效。3.根据RT-qPCR结果显示,无论在细胞RILI模型还是动物RILI模型中,经hUCMSCs治疗后的miR-29b表达量呈现不同程度的上升。表明miR-29b具有抗纤维化作用。4.两种RILI模型中,经hUCMSCs治疗后促纤维化基因FSTLI和SPARC随着miR-29b表达量的上升而呈现下降趋势。进一步提示着hUCMSCs介导RILI修复的分子机制。5.明确miR-29b调节下游靶标基因FSTL1和SPARC。