肾癌起病隐匿,多发现较晚,对于分期较晚的患者,常常需要进行化疗以延缓患者生存期,但肾癌对化疗极不敏感,常规化疗方案效果较差。以索拉非尼为代表的靶向药物的出现,曾为肾癌化疗带来希望,然而随着研究的深入,发现索拉非尼治疗晚期肾癌的远期效果欠佳,并且在其他肿瘤的靶向治疗研究中发现,不仅会伴有肿瘤耐药出现,还可能会增加残存肿瘤的恶性度。肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞(CSC)的存在,是肿瘤发生、发展、转移、复发和化疗抵抗的根源,由此推测肾癌耐受靶向治疗的可能原因是由于肾癌中CSC的存在。由于肿瘤干细胞多处于GO期,化疗只对分裂期细胞有效,化疗后存活下来的CSC苏醒后再次进行分化,从而致使化疗失败；CSC的识别关键在于筛选可靠的标志物,已有研究证实CD133、CD34、CD105、CD44等在其他肿瘤中有不同程度表达,可能与肿瘤干细胞密切相关；而CSC干性特点的维持依赖于某些特定基因的表达,这些特定基因参与调节CSC的自我增殖、分化和耐药,而研究证实基因Oct3/4、Bmi1、β-catenin和Nanog可能与肿瘤干细胞有不同程度相关；有研究表明肿瘤中的侧群细胞(SP)被认为是一种可能富含CSC的细胞群,能表现出较强的干细胞特性,SP细胞的筛选是基于细胞膜上转运蛋白ABCG2的表达,而ABCG2不仅与SP细胞相关,更与各种肿瘤的耐药相关,且被证实可能是肿瘤干细胞标志物之一。另外,乏氧环境可促进ABCG2蛋白的表达,肿瘤乏氧微环境催生的乏氧因子被认为与肿瘤的恶性度、耐药相关,可能参与肿瘤干细胞干性特点的维持。CSC的研究在其他肿瘤中开展较早,但肾癌干细胞的研究仍处于早期阶段。本课题选用FCM、Western Blot、免疫荧光、RT-qPCR等技术,分别从细胞实验和动物实验层次,对肾癌细胞系786-0中多种可能的肿瘤干细胞相关表达进行检测,并分析了靶向药物索拉非尼对这些表达的影响。本课题的开展将有助于拓展肾癌干细胞的研究,帮助探索肾癌耐受靶向治疗的原因,为肾癌的诊断、预后判断及化疗提供新的思路和线索。第一章索拉非尼对肾癌细胞系786-O的体外抑制作用及细胞周期影响目的：探讨评价靶向药物索拉非尼对肾癌细胞系786-0的体外抑制、促进凋亡作用及对其细胞周期的影响情况。方法：选用786-0肾癌细胞系,进行复苏培养,分别将2.5μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM不同浓度的索拉非尼作用于细胞系,收集不同时间点(0h,24h,48h,72h,96h)的细胞,先选用MTS检测不同时间点及不同浓度组细胞的增殖情况,后选用FCM方法检测细胞凋亡及细胞周期改变。结果：1.细胞增殖检测结果：不同作用浓度和作用时间组的细胞增殖活性检测换算为抑制率,经多因素析因设计资料的方差分析,浓度和时间的主效应分析结果F值分别为：57.681、126.0,P均<0.01,差异明显；并且两者之间存在明显交互作用(F=4.410,P<0.01)。总体结果提示：随着作用时间延长和作用浓度的增加,索拉非尼对肾癌细胞系786-0抑制作用呈逐渐增强趋势,其中10.0μM浓度抑制作用最强。2.细胞凋亡检测结果：FCM检测细胞凋亡,选用10.0μM为作用浓度,选0h、24h、48h、72h、96h点作为时间分组。总体凋亡率各时间组较0h对照组比较,经方差分析F=1893.68,P<0.001,24h组与对照组无明显差别(P>0.05),其余各个时间组较对照组均差别显著(P<0.05)。3.细胞周期检测结果：FCM检测细胞周期,0h、24h、48h、72h、96h各时间点G0/G1期细胞的比例分别为：57.37±1.03%、58.82±1.34%、61.03±1.28%、64.56±2.61%、70.90±1.11%,呈逐渐增高趋势。各时间组与Oh对照组比较,经方差分析F=34.95,P<0.001,24h组无明显差别(P>0.05),48h组开始差异显著(P<0.05),72h、96h组差异非常显著(P<0.01)。结论：索拉非尼对肾癌细胞系786-0体外抑制作用明显,可以明显促进其凋亡并阻滞其分化停止于G0/G1期,从而达到肿瘤抑制的目的；而作用后G0/G1期细胞比例增加,可能与肾癌干细胞的存在相关。第二章肾癌细胞系786-O肿瘤干细胞标志物表达及索拉非尼对其表达影响目的：探讨肿瘤干细胞相关分子标志物CD133、CD105、CD34、CD44、CD24在肾癌细胞系786-O中表达,并分析靶向药物索拉非尼对这些标志物表达影响。方法：在细胞实验中,选用FCM分别检测胞系中肿瘤干细胞相关标志物CD133、 CD105、CD44、CD24、CD34的表达情况,然后选用10.0μM作为作用浓度对786-0肾癌细胞进行干预,再检测不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)各种标志物表达改变情况。后在BALB/C-NU小鼠身上建立动物成瘤模型,对照组和给药组小鼠各6只,模型建立成功后选用索拉非尼对给药组小鼠进行连续灌胃处理,处死小鼠并处理瘤体,选用免疫荧光方法,检测对照组与给药组瘤体组织标本以上标志物表达情况。结果：1细胞实验流式检测：①CD133在各个时间组表达阳性率均较低,对照组0.55±0.05%,96小时组升高至4.14±0.15%。各时间组与0h对照组比较经方差分析F=291.585,P值<0.001,24h组无明显差别(P>0.05),48h组差别显著(P<0.05),72h组和96h组差别非常显著(P<0.01)；②CD105表达阳性率稍高,对照组4.04±0.08%,96h组升至12.36±1.23%。各时间组与0h对照组比较经方差分析F=4.853,P<0.001,24h组及48h组与对照组相比无明显差别(P>0.05),72小时组差别显著(P<0.05),96h组差别非常显著(P<0.01)；③CD34表达较低,对照组0.23±0.02%,96小时组升至1.28±0.05%。各时间组与Oh对照组比较经方差分析F=714.105,P<0.01,均差异显著(P<0.05))；④CD44在各个时间组均表达率较高,各时间组与0h对照之间比较经方差分析,F=2.019,P>0.05,差别不明显；⑤CD24在各时间组均表达率较高,各时间组与对照组比较经方差分析F=1.075,P=0.419,差别不明显。2.动物实验免疫荧光结果：动物成瘤模型良好,采用免疫荧光方法检测给药组及对照组瘤体组织中CD133、CD105、CD34、CD44、CD24表达,结果显示：CD133、CD105、CD34在对照组瘤体组织表达较少,但在给药组瘤体组织表达明显提高；而CD44、CD24在对照组和给药组瘤体组织均表达较高,且两组之间无明显区别,与细胞实验结果相符。结论：CD133、CD105、CD34在肾癌细胞系786-0存在少量表达,其表达可以被索拉非尼提高,而CD44、CD24在肾癌细胞系786-0中表达阳性率较高,且索拉非尼作用前后无明显改变。提示CD133、CD105、CD34可能是肾癌细胞系786-0的肿瘤干细胞标志物,而CD44、CD24不适合。第三章：肾癌细胞系786-O肿瘤干细胞相关基因表达及索拉非尼对其表达影响目的：检测肿瘤干细胞的相关基因Oct3/4、Bmi1、β-catenin、Nanog在肾癌细胞系786-0中的表达,并探讨索拉非尼对这些基因表达的影响。方法：本部分研究在第二章研究的基础上,分别从细胞实验和动物体内实验两个方面,检测肿瘤干细胞相关基因Oct3/4、Bmi1、β-catenin、Nanog在各组细胞和动物瘤体组织标本的表达情况。在细胞实验中,选用RT-qPCR技术首先分别检测胞系中可疑干细胞基因表达,然后选用1O.0μM索拉非尼进行干预,检测不同时间组(0h、24h、48、72h、96h)各基因的表达改变情况。对动物成瘤药物干预实验所获得的给药组及对照组瘤体组织标本,重复以上检测。结果：1.细胞实验各基因检测结果：①Oct3/4基因的mRNA相对表达量在24h、48h、72h、96h组分别为：1.21±0.10、3.28±0.35、4.38±0.41、7.55±0.36；②Bmi1基因的mRNA相对表达量在24h、48h、72h、96h组分别为：1.12±0.11、2.96±0.27、6.12±0.44、10.68±0.78,③β-catenin基因的mRNA相对表达量在24h、48h、72h、 96h组分别为：1.12±0.12、3.10±0.16、4.26±0.22、8.46±0.68；④Nanog基因的mRNA相对表达量在24h、48h、72h、96h组分别为：1.21±0.15、1.48±0.13、4.35±0.29、6.82±0.36。各基因不同时间组与0h对照组比较经方差分析,24h组均无明显差异(P>0.05),48h组开始差异显著(P<0.05),表达明显增加。2.动物实验各基因检测结果：：①Oct3/4基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组：1.25±0.37、9.60±3.29；②Bmi1基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组：1.30±0.36、6.58±1.49；③β-catenin基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组：1.06±1.36、39.27±21.89;④Nanog基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组：0.98±0.27、77.22±24.0。各基因给药组与对照组比较,经独立样本t检验,均差异显著(P<0.05)。结论：肾癌细胞系786-0中可以检测到基因Oct3/4、β-catenin、Nanog、Bmi1不同程度的表达,并且其表达水平可以被靶向药物索拉非尼提高。提示肾癌细胞系786-0中可能存在极少量的肿瘤干细胞,而Oct3/4、β-catenin、Nanog、Bmi1基因均可能是肾癌干细胞的相关基因。第四章：索拉非尼对肾癌细胞系786-O中SP细胞比例及ABCG2、 HIF-1α、HIF-2α表达的影响目的：检测肾癌细胞系786-0中SP细胞比例及ABCG2、HIF-1α、HIF-2α的表达,探讨索拉非尼对肾癌细胞系中SP细胞比例及ABCG2、HIF-1α、HIF-2α表达的影响情况。方法：本部分研究在第三章研究的基础上,先选用FCM检测了786-0肾癌细胞中SP细胞比例及索拉非尼对其不同作用时间后比例改变情况。由于ABCG2、HIF-1α、 HIF-2α与SP细胞比例及肿瘤干细胞均相关,随后在体外细胞实验中,我们分别选用Western Blot和RT-qPCR技术,从蛋白和基因水平对索拉非尼不同作用时间组细胞进行.ABCG2、HIF-1α、HIF-2α的蛋白和基因检测。最后,为验证以上细胞实验结果,对动物成瘤模型药物干预实验中所获得的对照组及给药组瘤体组织标本,重复以上蛋白和基因水平上的检测。结果：1.SP细胞比例检测：对照组及24h、48h、72h、96h组SP细胞比例矫正值分别：1.06±0.05%、1.21±0.12%、2.66±0.28%、14.05±1.52%、41.27±4.74%,各个时间组与oh对照组之间比较,经方差分析F=90.643,P<0.001,24h组与对照组比较差异不明显(P>0.05),48h、72h及96h组与对照组比较差异显著(P<0.05)。2.细胞实验Western Blot结果：以GADPH作为蛋白定量内参,ABCG2、 HIF-1α、HIF-2α各自灰度值的不同时间组与0h对照组之间比较,经方差分析F值分别为：293.85、281.956、511.717,P值均<0.001,均差别明显,提示ABCG2、 HIF-1α、HIF-2α三种蛋白在肾癌细胞系786-0中均存在表达,且可以被索拉非尼明显提高。3.动物实验Western Blot结果：对照组及给药组瘤体组织标本内ABCG2、 HIF-1α蛋白表达灰度值比较,经独立样本t检验,差别均有统计学意义(P<0.05)。提示ABCG2、HIF-1α蛋白在给药组瘤体组织内表达均较对照组内明显提高。而HIF-2α蛋白表达在加药组和对照组比较两组之间差别不明显(P>0.05)。4.细胞实验RT-qPCR结果：ABCG2基因的mRNA相对表达量在24h、48h、 96h组分别为：1.21±0.19、2.34±0.19、3.23±0.24、5.12±0.16；HIF-1α基因的mRNA相对表达量在24、48h、72h、96h组分别为：1.14±0.16、3.50±0.28、7.53±0.27、10.67±0.75；HIF-2α基因的mRNA相对表达量在24h、48h、72h、96h组分别为：1.29±0.15、6.39±0.40、21.44±1.75、42.37±3.66。各基因各时间组与0h对照比较,分别经方差分析：均24h组无明显差异(P>0.05),48h、72h、96h组差异显著(P<0.05)。5.动物实验RT-qPCR结果：ABCG2基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组分别为：0.89±0.21、16.27±6.62；HIF-1α基因基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组分别为：0.98±0.35、9.60±3.29;HIF-2α基因的mRNA相对表达量在对照组和给药组分别为：1.05±0.39、6.58±1.49。各基因给药组与对照组比较,经独立样本的t检验,均差异显著(P<0.05)结论：肾癌细胞系786-0中可以检测到少量比例的SP细胞,并且其比例可以被索拉非尼提高。肾癌细胞系786-0中同样可以检测到不同程度ABGC2、HIF-1α和HIF-2α的表达,且索拉非尼作用后其表达水平提高。提示所检测到的SP细胞可能是富含肾癌干细胞的细胞群,而ABGC2、HIF-1α和HIF-2α的表达可能与肾癌细胞系786-O对索拉非尼的化疗耐受相关。