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目的原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我国常见的恶性肿瘤之一,目前肝癌患者化疗抵抗现象十分严重。本研究将初步明确肝癌患者对奥沙利铂(Oxaliplatin,Oxa)治疗敏感性降低和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染相关,并证实HBV相关肝癌细胞分泌的外泌体通过激活分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)途径诱导肝癌细胞凋亡抵抗的分子学机制,从而为提高肝癌患者的化疗敏感性的研究提供相关理论基础。方法1收集华北理工大学附属医院HBV相关原发性肝癌患者(HbsAg阳性、HBV DNA复制的肝癌患者)及非HBV相关原发性肝癌患者(HBV、HCV均阴性的肝癌患者)经奥沙利铂(TACE:130mg/m~2)治疗前后的资料,进行统计学分析,比较两组患者治疗后肿瘤体积的变化情况;2体外培养肝癌细胞HepG2细胞;收集我院HBV阳性患者的血清(HBV DNA复制量>1.0×10~9拷贝/ml)和健康体检者血清(HBV、HCV均阴性)分别作用HepG2细胞48h,弃去上清液后,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)清洗8-10遍,加入纯DMEM培养基继续培养,分别取0h、12h、24h、48h、72h和96h等不同时间段细胞上清液,实时荧光定量PCR仪检测上述上清液中HBV DNA含量;留取上述血清作用后的细胞上清液,采用外泌体提取试剂盒提取细胞上清液中的外泌体,利用Western Blot、透射电镜和Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体进行鉴定;3将上述提取外泌体分别作用肝癌细胞12h后,奥沙利铂继续作用细胞24h,收集细胞,提取蛋白,利用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Bcl-2的表达情况;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;同时采用Western Blot检测CMA途径关键分子Lamp2a的表达情况;4 shRNA干扰技术沉默HepG2细胞内Lamp2a基因,外泌体作用sh-Lamp2a HepG2细胞12h后,加入Oxa继续作用细胞24h,流式细胞术检测细胞凋亡水平;5采用SPSS17.0软件进行统计学分析,采用t检验或者单因素方差分析进行组间比较。结果1通过收集肝癌患者资料,选取Child-Pugh分级和BCLC分期相同的两组肝癌患者,统计学分析两组患者分别在性别、年龄方面无明显差异。统计分析非HBV相关肝癌患者和HBV相关肝癌患者经Oxa(TACE:130mg/m~2)治疗3个月后肿瘤体积的减小程度分别为(61.45±14.35)%和(36.81±15.27)%,P<0.05,差异有统计学意义;2 HBV感染HepG2细胞后,实时荧光定量PCR分析上清液HBV DNA含量在96h达到1.5×10~4 copies/ml,收集该时间段上清液提取外泌体;透射电镜观察外泌体大量分布且形态为椭圆形囊泡,同时Western Blot测得外泌体中CD63、CD9明显表达,利用Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪检测HepG2细胞分泌外泌体粒径为150nm左右,同时测得HBV相关肝癌组和非HBV相关肝癌组外泌体浓度分别为(5.25±0.63)×10~100 particle/ml和(4.95±0.87)×10~100 particle/ml,两组外泌体浓度分布无统计学意义。3 HBV相关肝癌外泌体作用肝癌细胞,通过Western Blot检测显示凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达下调而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显上调;流式细胞术检测HBV相关肝癌外泌体作用肝癌细胞后的细胞凋亡率为(45.21±7.69)%,较对照组(54.21±7.69)%明显减低;同时Western Blot表明CMA途径关键分子Lamp2a的表达较对照组明显上调。4成功干扰细胞内Lamp2a基因,HBV相关肝癌外泌体联合Oxa作用sh-Lamp2a HepG2细胞后,流式细胞仪检测细胞凋亡率(71.34±12.98)%较对照组(56.16±11.62)%明显上调。结论1 HBV相关肝癌细胞通过外泌体介导肝癌细胞对奥沙利铂的化疗抵抗;2HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径下调肝癌细胞对奥沙利铂的化疗敏感性。图7幅;表1个;参41篇。