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手足口病（Hand,foot and mouth disease,HFMD）是一种法定丙类传染性疾病,能够由多种肠道病毒血清型引起。HFMD多发于5岁以下儿童,目前研究表明造成该病的主要病原体有人肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）、柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A 6,CVA6）、CVA10、CVA16和CVA2[1,2]。CVA2衣壳由四种结构蛋白（VP1,VP2,VP3,VP4）组成,其中VP1含有的结合表位能与细胞受体特异性识别[3]。目前,关于CVA2蛋白功能的研究较为缺乏,根据其它肠道病毒的研究,推测CVA2 VP1、VP2和VP3可含有抗原表位能促使机体产生抗病毒的中和抗体,因此本研究选择了CVA2的VP1和VP3片段,将CVA2-VP1和CVA2-VP3部分基因分别整合入pGEX-6p-1载体,并经诱导、纯化免疫等步骤最终获得兔抗血清并进行鉴定,为研究CVA2提供了结构蛋白抗原检测的方法。在研发疫苗过程中,有两个非常重要的技术环节:一是候选疫苗株的筛选;二是建立动物模型用以评价候选疫苗的体内保护效力。本研究作为多价HFMD疫苗研发项目的子课题,主要目的是建立CVA2的主动免疫保护模型以及对候选疫苗株进行初步筛选。动物模型是评价候选疫苗效力最有效的工具。其中,通过小鼠感染模型评价EV71、CVA16、CVA6、CVA10全病毒灭活疫苗及相应的病毒样颗粒的保护效力已有相关报道[4-5]。为获得高滴度、高产量的疫苗候选株,制备全病毒灭活候选疫苗,本研究对CVA2-1580、CVA2-1730、CVA2-1881以及CVA2-2703这4株RD细胞分离毒株进行Vero细胞传代培养。在完成11代培养过后,选取病毒滴度较高的CVA2-1730作为候选疫苗株进行10层细胞工厂培养,并获得了一定数量的病毒实心颗粒（Full particle,FP）和空心颗粒（Empty particle,EP）用于疫苗体液免疫原性及体内保护效力的研究。在接种灭活疫苗过程中,被接种者通常需要进行两次免疫以产生较高强度的免疫应答和免疫持久性。而初次免疫和加强免疫之间以及加强免疫和攻毒实验之间都需要一定的时间间隔,产生高水平的保护性中和抗体,所以客观上需要获得能够致病或致死大日龄小鼠的攻毒株。如选育最低可使14日龄小鼠感染后致病致死的攻毒株,采用新生小鼠第3日、第9日初免、加强免疫,第14攻毒,连续观察14日的试验方案,观察小鼠耐受性和存活率,计算体内保护效力。自然存在和细胞分离的肠道病毒A组和部分B组血清型野生型病毒,颅内途径接种病毒后,仅能够致死三日龄以下的乳鼠。因此为获得可致死大日龄小鼠的攻毒株,一种常见策略是选育小鼠适应株。本研究为获得能够致死大日龄昆明小鼠的攻毒株,通过颅内感染途径,将CVA2-1388在昆明小鼠体内不断适应性传代,在不断尝试提高病毒滴度（RD细胞传代培养、浓缩病毒）以及更换攻毒途径后,最终获得能够稳定致死14日龄昆明小鼠的CVA2攻毒毒种库。最终本研究将能够稳定致死14日龄昆明小鼠的毒种作为攻击毒,将全病毒灭活的CVA2-1730-R11V11的FP作为抗原用于免疫小鼠,成功建立CVA2的主动免疫保护模型,并对CVA2候选疫苗进行了免疫接种后的耐受性及体内保护效力的评估。结果证明候选CVA2灭活疫苗小鼠动物模型的免疫-攻毒试验支持其进行临床研究的申报,也适合与其它HFMD相关肠道病毒（包括EV71）进行配伍配方研究,开展多价HFMD灭活疫苗的研发。