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原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是全球首位不可逆转的致盲眼病，其发病率随着年龄的增加而增高。目前，其发病机制尚未完全阐明。其中，病理性高眼压是其重要的危险因素。有研究证实氧化应激(oxidative stress,OS)参与了POAG的发生发展。在氧化应激条件下，小梁网发生病理改变，导致房水流出阻力增加，眼压升高，进而引起视网膜神经节细胞进行性不可逆性减少，出现视野的丢失。因此，探讨POAG的分子发生机制是预防和治疗POAG的关键。
氧化应激产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础。小梁网细胞(trabecular meshwork cell,TMC)是前房对氧化损伤最敏感的细胞之一。研究发现，在细胞水平上，ROS可能通过刺激TMC的凋亡和炎症通路而导致POAG的发生。氧化应激可诱导TMC出现典型的POAG的改变，包括细胞外基质堆积、细胞凋亡、细胞骨架破坏、质粒和溶酶体的结构及功能改变等。POAG患者易受氧化损伤，因为他们的总抗氧化能力降低了60%-70%。因此，我们认为氧化应激参与了POAG的发生和发展。
面对氧化应激，机体可启动一套复杂的应答系统，能诱导出一系列的保护性蛋白，以避免或缓解细胞受损害。核因子，类红细胞2样2(nuclear factor，erythroid2like2,Nrf2),被认为是一个保护性的抗氧化和抗炎反应的关键调节器,可以调节数百个基因的表达,不仅包括II相抗氧化酶,还包括不同生理病理过程中的一系列基因,如参与炎症反应、肿瘤发生和转移，组织重构和纤维化的基因，被认为是细胞氧化应激反应中的关键因子。典型的II相抗氧化酶包括NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NAD(P)H：quinone oxidoreductase1,NQO1)和血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)。NQO1通过减少内源性奎宁化合物来保护细胞膜免受氧化损伤；HO-1可催化血红素分解代谢的限速步骤，导致胆红素，游离铁和一氧化碳的形成，从而增强细胞对氧化损伤的抵抗力。
莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是一种异硫氰酸盐，富含于十字花科蔬菜中,是有效的Nrf2的激动剂,可以激活Nrf2，促使其进入细胞核，上调下游靶蛋白的表达，间接发挥抗氧化的作用。
有研究发现与正常人相比，Nrf2在青光眼患者的TMC中表达下调，另外，Nrf2的过表达可以促进正常人及青光眼患者TMC的生存能力，提示Nrf2通路可能在氧化应激参与的POAG发生发展中发挥一定作用。
研究目的：
探究Nrf2在H2O2诱导的人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cell,HTMC)氧化应激模型中的作用及机制，为探究POAG的发病机制提供新思路。
研究方法：
1.建立H2O2诱导的HTMC体外氧化应激模型并分组。
①建立H2O2诱导的HTMC体外氧化应激模型：对照组加入0μM H2O2；处理组分别加入100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1mM H2O2，作用3h后，CCK8法检测细胞存活率，选取合适的H2O2浓度进行下一步实验。
②分组
对照组：正常培养的HTMC；
模型组：HTMC氧化应激模型组，以600μM H2O2诱导氧化应激3h；
③检测各组氧化应激标志物、Nrf2及其相关蛋白的表达
分别用试剂盒法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、ROS含量及线粒体膜电位变化；利用qPCR及western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO1及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达；细胞免疫荧光法观察Nrf2、HO-1和NQO1的分布及表达。
2.用SFN增强Nrf2的表达后，检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化。
①分组
对照组：正常培养的HTMC；
模型组：HTMC氧化应激模型组，以600μM H2O2诱导氧化应激3h；
SFN预处理组：以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h；
SFN+H2O2组：以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h后，再用600μM H2O2诱导氧化应激3h；
②检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化
分别用试剂盒法检测MDA含量、SOD活力、ROS含量及线粒体膜电位变化；利用qPCR及western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO1及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达；细胞免疫荧光法观察Nrf2、HO-1和NQO1的定位及表达情况。
3.利用Nrf2小干扰RNA(small interfering RNA,si-RNA)抑制Nrf2表达后，检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化。
①分组
对照组：正常培养的HTMC；
模型组：HTMC氧化应激模型组，以600μM H2O2诱导氧化应激3h；
siRNA阴性转染组(siRNA-NC)：在HTMC中转染siRNA-NC后，再用600μM H2O2诱导氧化应激3h；
siRNA-Nrf2转染组(siRNA-Nrf2)：在HTMC中转染siRNA-Nrf2后，再用600μM H2O2诱导氧化应激3h；
③检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化
分别用试剂盒法检测MDA含量、SOD活力、ROS含量及线粒体膜电位水平变化；利用qPCR及western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO1及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达；细胞免疫荧光法观察Nrf2、HO-1及NQO1的分布及表达情况。
研究结果：
1.成功建立了H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激模型，600μM H2O2作用3h，细胞存活率显著降低、细胞内ROS含量增加、线粒体膜电位变化提示细胞向早期凋亡发展。细胞内脂质过氧化产物含量MDA显著增高，超氧化物歧化酶SOD活力显著降低，western blot显示Bcl-2/Bax蛋白表达比值显著下降。细胞免疫荧光显示，Nrf2在正常环境下少量表达于细胞质中，H2O2诱导成模后Nrf2有迁移入核表达趋势。
2.以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h，600μM H2O2诱导氧化应激3h。与模型组相比，SFN预处理+H2O2显著提升细胞存活率、降低细胞内的ROS含量、抑制线粒体膜电位由正常状态向早期凋亡的转变；细胞内MDA含量显著降低，SOD活性显著升高；Nrf2总蛋白、核蛋白、HO-1及NQO1的表达水平显著升高；Bcl-2/Bax比值上调。给予SFN预处理能有效提高细胞抗氧化能力，减轻氧化损伤。
3.以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h，Nrf2、HO-1及NQO1表达水平均显著升高；细胞免疫荧光显示，Nrf2荧光强度增强且大部分定位于细胞核，提示Nrf2迁移入核表达，并激活了HO-1及NQO1的表达。
4.在HTMC中转染Nrf2si-RNA后，Nrf2表达显著受抑制，同时HO-1及NQO1mRNA及蛋白水平显著降低。
5在HTMC中转染Nrf2si-RNA后，以600μM H2O2干预3h(siRNA-Nrf2转染组)，细胞存活率显著降低，细胞内ROS含量升高、线粒体膜电位变化提示细胞向早期凋亡发展；MDA含量显著增高，SOD活性显著降低；Nrf2总蛋白及核蛋白表达均显著降低，HO-1及NQO1表达亦显著降低，Bcl-2/Bax比值显著降低。Nrf2敲低显著抑制抗氧化相关基因表达，降低氧化应激抵御能力。
研究结论：
1.成功建立了H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激模型。模型组H2O2通过Bcl-2/Bax介导的线粒体途径诱导HTMC凋亡。氧化应激使细胞承受了脂质过氧化产物堆积以及抗氧化酶活力降低带来的损伤，细胞抗氧化能力下降。
2.Nrf2可通过激活HO-1及NQO1的表达显著提高细胞存活率，降低细胞凋亡率，从而减弱氧化应激所致损伤。
3.SFN在H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激模型中，能有效促进Nrf2的表达和核转位，提高下游抗氧化蛋白质的表达，抑制氧化应激，是有潜力的抗氧化损伤的保护剂。
4.Nrf2通路可能成为调控氧化应激参与的POAG发生发展的新靶点。
氧化应激产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础。小梁网细胞(trabecular meshwork cell,TMC)是前房对氧化损伤最敏感的细胞之一。研究发现，在细胞水平上，ROS可能通过刺激TMC的凋亡和炎症通路而导致POAG的发生。氧化应激可诱导TMC出现典型的POAG的改变，包括细胞外基质堆积、细胞凋亡、细胞骨架破坏、质粒和溶酶体的结构及功能改变等。POAG患者易受氧化损伤，因为他们的总抗氧化能力降低了60%-70%。因此，我们认为氧化应激参与了POAG的发生和发展。
面对氧化应激，机体可启动一套复杂的应答系统，能诱导出一系列的保护性蛋白，以避免或缓解细胞受损害。核因子，类红细胞2样2(nuclear factor，erythroid2like2,Nrf2),被认为是一个保护性的抗氧化和抗炎反应的关键调节器,可以调节数百个基因的表达,不仅包括II相抗氧化酶,还包括不同生理病理过程中的一系列基因,如参与炎症反应、肿瘤发生和转移，组织重构和纤维化的基因，被认为是细胞氧化应激反应中的关键因子。典型的II相抗氧化酶包括NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NAD(P)H：quinone oxidoreductase1,NQO1)和血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)。NQO1通过减少内源性奎宁化合物来保护细胞膜免受氧化损伤；HO-1可催化血红素分解代谢的限速步骤，导致胆红素，游离铁和一氧化碳的形成，从而增强细胞对氧化损伤的抵抗力。
莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是一种异硫氰酸盐，富含于十字花科蔬菜中,是有效的Nrf2的激动剂,可以激活Nrf2，促使其进入细胞核，上调下游靶蛋白的表达，间接发挥抗氧化的作用。
有研究发现与正常人相比，Nrf2在青光眼患者的TMC中表达下调，另外，Nrf2的过表达可以促进正常人及青光眼患者TMC的生存能力，提示Nrf2通路可能在氧化应激参与的POAG发生发展中发挥一定作用。
研究目的：
探究Nrf2在H2O2诱导的人眼小梁网细胞(human trabecular meshwork cell,HTMC)氧化应激模型中的作用及机制，为探究POAG的发病机制提供新思路。
研究方法：
1.建立H2O2诱导的HTMC体外氧化应激模型并分组。
①建立H2O2诱导的HTMC体外氧化应激模型：对照组加入0μM H2O2；处理组分别加入100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1mM H2O2，作用3h后，CCK8法检测细胞存活率，选取合适的H2O2浓度进行下一步实验。
②分组
对照组：正常培养的HTMC；
模型组：HTMC氧化应激模型组，以600μM H2O2诱导氧化应激3h；
③检测各组氧化应激标志物、Nrf2及其相关蛋白的表达
分别用试剂盒法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、ROS含量及线粒体膜电位变化；利用qPCR及western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO1及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达；细胞免疫荧光法观察Nrf2、HO-1和NQO1的分布及表达。
2.用SFN增强Nrf2的表达后，检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化。
①分组
对照组：正常培养的HTMC；
模型组：HTMC氧化应激模型组，以600μM H2O2诱导氧化应激3h；
SFN预处理组：以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h；
SFN+H2O2组：以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h后，再用600μM H2O2诱导氧化应激3h；
②检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化
分别用试剂盒法检测MDA含量、SOD活力、ROS含量及线粒体膜电位变化；利用qPCR及western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO1及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达；细胞免疫荧光法观察Nrf2、HO-1和NQO1的定位及表达情况。
3.利用Nrf2小干扰RNA(small interfering RNA,si-RNA)抑制Nrf2表达后，检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化。
①分组
对照组：正常培养的HTMC；
模型组：HTMC氧化应激模型组，以600μM H2O2诱导氧化应激3h；
siRNA阴性转染组(siRNA-NC)：在HTMC中转染siRNA-NC后，再用600μM H2O2诱导氧化应激3h；
siRNA-Nrf2转染组(siRNA-Nrf2)：在HTMC中转染siRNA-Nrf2后，再用600μM H2O2诱导氧化应激3h；
③检测氧化应激标志物、Nrf2及相关蛋白表达的变化
分别用试剂盒法检测MDA含量、SOD活力、ROS含量及线粒体膜电位水平变化；利用qPCR及western blot法检测Nrf2、HO-1、NQO1及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达；细胞免疫荧光法观察Nrf2、HO-1及NQO1的分布及表达情况。
研究结果：
1.成功建立了H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激模型，600μM H2O2作用3h，细胞存活率显著降低、细胞内ROS含量增加、线粒体膜电位变化提示细胞向早期凋亡发展。细胞内脂质过氧化产物含量MDA显著增高，超氧化物歧化酶SOD活力显著降低，western blot显示Bcl-2/Bax蛋白表达比值显著下降。细胞免疫荧光显示，Nrf2在正常环境下少量表达于细胞质中，H2O2诱导成模后Nrf2有迁移入核表达趋势。
2.以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h，600μM H2O2诱导氧化应激3h。与模型组相比，SFN预处理+H2O2显著提升细胞存活率、降低细胞内的ROS含量、抑制线粒体膜电位由正常状态向早期凋亡的转变；细胞内MDA含量显著降低，SOD活性显著升高；Nrf2总蛋白、核蛋白、HO-1及NQO1的表达水平显著升高；Bcl-2/Bax比值上调。给予SFN预处理能有效提高细胞抗氧化能力，减轻氧化损伤。
3.以Nrf2激动剂SFN5μM预处理HTMC24h，Nrf2、HO-1及NQO1表达水平均显著升高；细胞免疫荧光显示，Nrf2荧光强度增强且大部分定位于细胞核，提示Nrf2迁移入核表达，并激活了HO-1及NQO1的表达。
4.在HTMC中转染Nrf2si-RNA后，Nrf2表达显著受抑制，同时HO-1及NQO1mRNA及蛋白水平显著降低。
5在HTMC中转染Nrf2si-RNA后，以600μM H2O2干预3h(siRNA-Nrf2转染组)，细胞存活率显著降低，细胞内ROS含量升高、线粒体膜电位变化提示细胞向早期凋亡发展；MDA含量显著增高，SOD活性显著降低；Nrf2总蛋白及核蛋白表达均显著降低，HO-1及NQO1表达亦显著降低，Bcl-2/Bax比值显著降低。Nrf2敲低显著抑制抗氧化相关基因表达，降低氧化应激抵御能力。
研究结论：
1.成功建立了H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激模型。模型组H2O2通过Bcl-2/Bax介导的线粒体途径诱导HTMC凋亡。氧化应激使细胞承受了脂质过氧化产物堆积以及抗氧化酶活力降低带来的损伤，细胞抗氧化能力下降。
2.Nrf2可通过激活HO-1及NQO1的表达显著提高细胞存活率，降低细胞凋亡率，从而减弱氧化应激所致损伤。
3.SFN在H2O2诱导的人眼小梁网细胞氧化应激模型中，能有效促进Nrf2的表达和核转位，提高下游抗氧化蛋白质的表达，抑制氧化应激，是有潜力的抗氧化损伤的保护剂。
4.Nrf2通路可能成为调控氧化应激参与的POAG发生发展的新靶点。