里氏木霉（Trichoderma reesei）在基因打靶时的频率很低,通常只有不到10%,这使得在里氏木霉中进行基因改造相对困难。之前解决里氏木霉同源重组率低的方法是通过敲除非同源末端修复途径（NHEJ）中的相关修复基因ku70,来提高外源基因的打靶效率。然而敲除这些重要的修复基因可能会导致基因组不稳定和自发突变的累积,因此在不破坏NHEJ途径的条件下利用RNAi沉默里氏木霉NHEJ途径相关基因从而获得高同源重组率尤为重要。本文以里氏木霉Rut-C30菌株作为初始菌株,通过RNAi方法对里氏木霉NHEJ途径ku70基因进行沉默,构建NHEJ沉默菌株,将人胰岛素原基因表达载体转化沉默菌株中进行表达,减少了里氏木霉转化子筛选的工作量,同时避免因NHEJ途径缺失带来的菌株不稳定性,为里氏木霉基因工程改造奠定理论基础,同时也为一些重要酶制剂应用里氏木霉中提供重要而坚实的理论和技术基础。本研究的结果如下:（1）首先构建了含两种不同的RNA工具的载体pCB1300-Pku70T和pCB1300-dual,利用根癌农杆菌介导里氏木霉转化,分别利用乙酰胺筛选和潮霉素筛选标记筛选里氏木霉转化子,成功构建了里氏木霉NHEJ途径沉默菌株。证明了乙酰胺筛选标记筛选方法用于里氏木霉筛选转化子是可行的,并且乙酰胺筛选方法得到的转化子与潮霉素筛选相比,转化子数量明显少于潮霉素筛选。结果表明构建的RNAi沉默表达载体能够作为有效的基因沉默工具运用到里氏木霉,且双反向启动子介导RNAi使NHEJ途径的ku70基因表达量下降最高达70%,效果更为明显。（2）以载体pCAMBIA1300为载体骨架,构建了人胰岛素原（Prosoinlin）基因表达载体pCB1300-INS,并将其转化NHEJ途径沉默菌株T4和野生型菌株Rut-C30,得到其同源重组率为32.15%,野生型的同源重组率为6.6%,同源重组率明显增加。（3）比较了定向整合转化子T-7和随机插入转化子T-1在转录水平、蛋白表达、发酵产酶的区别。转录水平上,通过qPCR分析定向整合转化子T-7和随机插入转化子T-1的cbh1基因表达量,定向整合转化子cbh1基因下降约67%,经统计学分析表现出极限著差异。而Prosoinlin基因表达量却无明显变化。蛋白表达方面,定向整合转化子的CBHI表达减少最多,几乎不表达,而随机整合转化子的CBHI有少量表达。发酵产酶方面,定向整合转化子T-7的INS酶活为35.6mIU/L、随机整合转化子的INS酶活为16.1mIU/L,定向转化子T-7 INS酶活明显高于随机插入整合转化子T-1的INS酶活。定向整合转化子T-7的FPA酶活为0.36IU/mL,随机整合转化子T-1的FPA酶活0.98IU/mL,T-7的FPA酶活大大降低,这表明CBHI的分泌量减少能提高外源基因在里氏木霉中的表达。