研究背景 核酶(ribozyme)是一类具有生物催化活性的RNA分子，可特异性结合并切割靶RNA，从而达到有效阻断基因表达的目的。目前发现的核酶有七种，包括锤头状核酶、发卡状核酶、HDV核酶、VS核酶、RNase P和Ⅰ类及Ⅱ类内含子核酶。在核酶用于基因治疗的研究中，因为锤头状和发夹状核酶的片断短，结构简单，催化活性较高，因此研究较多。但这两类核酶均来源于植物类病毒，虽然在体外和细胞水平对其抑制基因表达的研究进行的比较深入，但如何才能应用到临床仍存在巨大障碍，包括如何将其带入特定靶细胞，使其在细胞内高效表达并能维持一定时间以及可调控表达等等问题。因此亟需寻找新的途径和方法，以求能有所突破。 HDV是目前发现的唯一一种在人类细胞内具有天然核酶活性的病毒，是由1.7kb组成的缺陷型负链RNA病毒，呈环状。其在细胞内的复制是通过滚环机制进行的RNA指导的RNA复制，由核酶将长的转录物剪切成单位长度的RNA。病毒核心需要乙肝病毒(HBV)的HBsAg进行包装，才能形成具有感染活性的成熟病毒颗粒。所以HDV总是伴随HBV感染，否则HDV的感染就是一个自限性的过程而不能形成慢性感染。因此HDV核酶应该更适应人类细胞内的环境，而具有较高的核酶活性。HDV核酶较锤头状和发夹状核酶结构复杂，呈多个茎环组成的假结样结构，因而可能更具有稳定性。 由于HDV与HBV的特殊关系，更为我们提供了想象空间，可否利用这种关系，使HDV核酶具有肝细胞特异性，尤其在用于乙型肝炎的基因治疗方面发挥其独特的作用?目前这方面的研究很少，特别是细胞内的研究更少。我们的主要目的是想探讨HDV核酶在细胞内对HBV复制及其抗原表达的抑制作用如何，以求证其是否具有实际开发应用价值。才沙义丈笋医学脸麒少学少忿灵‘ 要保证核酶在细胞内能正常发挥催化作用，必须做到以下几点:①核酶与其靶位点能有效结合:②核酶在细胞内要高效表达，即达到足够的量;③核酶要与其靶RNA共定位，即位于细胞的同一部位。因此我们将实验分为以下几部分进行:第一部分筛选合适的靶位点:第二部分构建核酶高效真核表达载体;第三部分真核细胞转染。方法 (l)提取HePG2.2.巧细胞全基因组DNA，PCR扩增其基因组整合的HBv全 基因组序列，产物经纯化后插入pGEM一T载体。 (2)从NCBI database中搜寻到202条不同类型的HBV全基因序列，用分析 软件(Veeto:NTI Suite6)进行比对，按连续15个以上大于90%相同碱 基的序列为标准，寻找高度保守序列。 (3)体外转录HBV全基因组RNA。针对保守序列设计合成反义寡核昔酸链 (ODNs)，进行RNaseH位点筛选实验。 (4)根据文献报道及选择的作用位点设计合成HDV反式作用核酶的cDNA， 将其重组入pGEM一42质粒并体外转录合成HDV核酶。同法体外转录合 成含有靶位点的RNA片段。对HDV核酶的活性进行体外测定。 (5)设计合成t州AVal启动子cDNA，与puc19质粒重组构建载体Ptv。然后 用PcR的方法将HDv核酶的cDNA与Ptv重组，载体命名为ptVHRZ。 (6)以PtVHRZ载体中的HDv核酶为模板，PCR扩增后与真核表达载体 peDNA3.0重组，构建载体pcDHRz。 (7)pCR扩增HDV核酶eDNA序列，与psileneer 1 .0刁6载体重组构建载体 PSURz。 (8)细胞转染:于转染前一天将HePG2.2.巧细胞接种24孔培养板，按下列分 组进行细胞转染:Lipofeetamine、psURZ、ptVHRZ、peDHRz、pSURz+ ptVHRz、pSURz+peDHRz、psileneer 1 .0一6和pcDNA3.0，每组设3个 复孔，重复实验三次。培养至24h时取出200 pl培养液同时加入等量新 鲜培养液，至48h后终止培养，取出全部培养液。 (9)用ELISA法检测培养液HBeAg和HBsAg的表达水平，所测数据用SPSS 统计软件进行处理。厂笋院麒里学企谐戈 (10)用实时荧光定量PCR法检测培养液中HBV含量的变化。 (11)收集转染后培养48h的细胞提取总RNA，合成地戈辛标记的与HDV核 酶保守序列互补的脱氧寡核昔酸探针，用点杂交方法检测核酶的表达情 况。体外转录HDV核酶作为阳性对照，单纯脂质体组作阴性对照。结果 (l)共找出37处高度保守序列。其中X和C基因区19处;前52和S区12 处。从C基因区挑选7处符合HDV核酶切割要求的保守序列，经RNase H实验发现2174~2191位点有明显的切割反应，故选择此处作为HDV 核酶靶作用位点。 (2)在体外反应条件下，所构建的核酶能对底物进行切割，在反应巧分钟时 即可见到切割产物带。经计算巧分钟时的切割百分率为51%，60分钟时 为56%，说明随反应时间延长切割产物有一定的增加，但无显著性差异。 (3)所构建的PtvHRZ、PcDHRZ和pSURZ三个载体，经测序证实与设计完全 相符。 (4)不同质粒转染HepG2.2.15细胞后24h及48h培养液中HBeAg和HBsAg 的ELIsA检测结果经统计学处理显示:转染24h时各质粒转染组的 HBeAg和HBsAg值均比单纯脂质体组低，