肺癌是常见恶性肿瘤之一,严重着威胁人类的健康。早期诊断肺癌转移,尤其是肺癌亚临床转移和微转移(micrometastasis),对于提高肺癌的治愈率和生存率至关重要。目前有关肺癌微转移机理的研究日益受到重视,良好的实验模型是准确揭示癌细胞的侵袭、转移生长特性,进而阐明其机理的基础。绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein, GFP)是近年来发现的一种化学性能稳定的分子,己经在多种细胞中获得表达,用于定位蛋白及示踪细胞等研究。肿瘤血管生成及侵袭是肿瘤转移的必要条件。血管内皮细胞生长因子 (Vascularendothelial growth factor ,VEGF)是重要的血管生成因子,在人体多数细胞均有表达,通过其受体 FLT 和 KDR 诱导新生血管形成。sFLT 是其可溶性受体,为 VEGF 功能抑制剂。近年来研究发现,VEGF 在许多实体瘤中过量表达,与肿瘤血管生成、生长和转移密切相关。但 VEGF 与肿瘤微转移的关系尚未见报道。肿瘤转移是一系列复杂的事件,突破基底膜是肿瘤细胞进行浸润和转移的最初和最关键阶段,细胞外基质的降解是突破基底膜的必须环节。基质金属蛋白酶系统(matrix metalloproteinase,MMP)是组织基底膜和细胞外基质的主降解者,因而 MMP在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用,其中以基质金属蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的作用尤为重要。近来对血液性肿瘤和卵巢癌组织和等研究表明,VEGF 可通过上调肿瘤细胞MMP-2、9 的表达,继而促进肿瘤侵袭。VEGF 在肺癌中有无此作用尚未见报道。本研究并以 Lewis 肺癌细胞(lewis lung carcinoma,LLC)为研究对象,利用基因克隆技术,构建绿色荧光蛋白标记的含鼠 VEGF 或 sFLT 全长序列的真核双表达载体,用脂质体法转染高转移 Lewis 肺癌细胞株,观察转染前后的细胞系对细胞生长、血管生成能力及基底膜侵袭能力的改变,并检测 VEGF 对金属蛋白酶 MMP-2、MMP-9 表达的影响;将转染后的细胞接种于 C57BL/6J 纯系小鼠,复制实验性和自发性微转移模型,观察 VEGF 对微转移形成的影响和相关因子表达的变化。最后还进一步从临床观察肺癌患者血清 VEGF 的水平与微转移的关系。主要结果如下:1. 以绿色荧光蛋白为报告基因,构建重组质粒转染鼠 lewis 肺癌细胞,利用肿瘤细胞侵袭实验、RT-PCR 、Western blot 等技术,观察转染后 VEGF 和 sFLT 在体外对 lewis 肺癌细胞株(LLC)侵袭和血管生成能力的影响。发现: 5<WP=11>第三军医大学博士学位论文1)利用基因克隆技术,成功构建了 pEGFP-VEGF 和 pEGFP-sFLT 真核双表达载体,并将两表达载体及 pEGFP 空载体转染 Lewis 肺癌细胞,并分别命名为 LLC-VEGF、LLC-sFLT 和 LLC-mock,转染后的细胞在体外均能稳定表达绿色荧光。检测转染后的肿瘤细胞发现,VEGF 及 sFLT 在体外对肿瘤细胞的生长无影响,提示 VEGF 可能是通过旁分泌途径作用于肿瘤细胞。2)肿瘤的转移与肿瘤血管生成及侵袭密切相关。血管内皮细胞粘附并向肿瘤移行才能实现肿瘤的血管生成。采用侵袭小室将肿瘤细胞与血管内皮细胞ECV304共培养,模拟体内癌细胞对血管内皮细胞的趋化作用。结果发现, LLC-mock 组、LLC-VEGF组和LLC-sFLT组迁移到膜背面的内皮细胞数分别是32±7.23个、97±10.26个和10±1.35个。即LLC-VEGF中过表达的VEGF能促进共培养的内皮细胞穿过基质,LLC-sFLT中高表达的sFLT能抑制共培养ECV304的迁移。在肿瘤细胞侵袭实验中,LLC-mock 组、LLC-VEGF组和LLC-sFLT组穿膜的细胞数分别为34±2.45个、75±15.11个和15±1.41个,统计学分析具有显著性差异(P<0.05)。表明VEGF能促进肿瘤细胞的侵袭能力,sFLT能明显抑制肿瘤细胞的侵袭能力。上述结果提示VEGF均能增强肿瘤的血管生成能力及侵袭能力。3)MMP-2 和 MMP-9 是主要的肿瘤侵袭因子,RT-PCR 和 Western Blot 技术检测发现,VEGF可对其表达在转录及翻译水平都有上调作用,而sFLT可特异性抑制VEGF的作用。由此可见,VEGF 可能是通过激活 MMP-2、MMP-9 的表达促进肿瘤细胞的侵袭能力,sFLT 则通过阻断 VEGF 的功能,从而抑制 MMP-2、MMP-9 的表达,降低肿瘤细胞的侵袭能力。4)MMP-2、9 以酶原形式分泌入细胞外基质,激活后才能发挥作用。利用明胶酶谱分析法检测 MMP-2、9 的活性时发现,与 LLC-mock 组相比,LLC-VEGF 组 MMP-2和 MMP-9 的含量均较高,而 LLC-sFLT 组较低(P<0.05)。且 MMP-2 的含量较 MMP-9高 (P<0.01)。提示 VEGF 能增强 MMP-2、9 的活化,sFLT 特异性地阻断这一效应。结果还显示,肿瘤细胞以活化 MMP-2 为主,提示 MMP-2 可能在肿瘤侵袭转移中起更为重要的作用。2. 采用小鼠成瘤实验,复制绿色荧光蛋白标记的实验性和自发性微转移模型,利用免疫组化、RT-PCR 和 Western blot 等技术,在体研究 VEGF 和 sFLT 对 Lewis 肺癌微转移灶形成及相关因子表达的影响。结果发现: 6<WP=12>第三军医大学博士学位论文1)实验性和自发性微转移模型分别在第 2 天和 1 周后检测到肺内绿色荧光蛋白示踪的微转移灶。实验性微转移灶在接种后第 2、4、7 天的平均直径分别为 20μm、40μm和 100μm,到接种后 10 天,平均直径迅速增大到 500μm。2)在