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研究背景和目的肝癌在全球肿瘤发病率位于第五位，占肿瘤致死原因的第三位。目前肝癌的治疗以手术、放疗、化疗等传统治疗方法为主，但治疗效果不理想。近些年来，肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤的研究、治疗提供了新的思路。越来越多的证据表明肿瘤组织是由不同的异质细胞构成，导致肿瘤发生和维持肿瘤生长的是肿瘤细胞中的极少一部分细胞，这些细胞即为“肿瘤干细胞”。这些细胞具有肿瘤干细胞特性：自我更新、分化及体内高致瘤等能力。肿瘤干细胞学说认为肿瘤干细胞是肿瘤组织形成、复发、转移的原因，也是肿瘤放疗、化疗失败的原因，故对肿瘤的治疗应针对肿瘤干细胞以达到根除肿瘤的目的。本研究旨在采用无血清悬浮球培养法从人肝细胞性肝癌细胞株中分离肝癌干细胞样细胞，初步探讨Akt通路调节其对化疗药物阿霉素的敏感性。方法1.将人肝癌细胞株PLC、HepG2、Hep3B置于无血清条件培养基中培养，形成细胞球，选用PLC细胞株进行后续实验。2.采用流式细胞术、克隆形成实验、诱导分化实验、SCID小鼠体内成瘤实验鉴定PLC细胞球（肝癌干细胞样细胞）的肿瘤干细胞特性。3. MTT法、流式细胞仪测定PLC细胞球对化疗药物阿霉素的敏感性。4.流式细胞术分析加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002、阿霉素共同孵育细胞球后，其凋亡率的变化。5. Western blot法比较PLC细胞球、PLC贴壁细胞中P-AKT1S473蛋白分子表达量及加入抑制剂LY294002作用于细胞球后，P-AKT1S473、AKT1蛋白分子表达量的变化。结果1.三株人肝细胞性肝癌细胞株在无血清条件培养基中均可以形成三维、立体的细胞球。2.肝癌干细胞标志物CD90在细胞球中的表达较贴壁细胞显著升高（P<0.01）。3. PLC细胞球经含血清培养基诱导分化后，可形成梭形、拉伸的非肝细胞样细胞。4.细胞球的克隆形成数目（123.00±28.48）为贴壁细胞（56.33±7.37）的2.18倍（P<0.05）。5.同样细胞数接种于SCID小鼠皮下7周后，细胞球的致瘤率明显大于贴壁细胞。6.以5μg/ml的阿霉素分别处理细胞球和贴壁细胞48h后，细胞球的增殖率（71.83±12.3）%明显高于贴壁细胞（[45.68±5.95）%（P<0.05）]，凋亡率（11.73±3.77）%显著低于贴壁细胞[（41.22±6.73）%（P<0.01）]，而以阿霉素5μg/ml和LY294002共同孵育细胞球后，其凋亡率（35.44±6.65）%显著增加（P<0.01）。7. Western blot检测到细胞球的P-AKT1S473蛋白分子表达量显著高于贴壁细胞（P<0.01），加入抑制剂LY294002处理细胞球后，P-AKT1S473蛋白表达量明显降低(P<0.05)，AKT1的表达量无明显变化。结论无血清悬浮球培养法可以从人肝癌细胞株中有效富集肝癌干细胞样细胞（细胞球），肝癌干细胞样细胞对化疗药物阿霉素具有耐药性，其耐药机制与Akt信号通路第473位点磷酸化AKT1分子有关，深入研究抑制该分子的靶向药物，从而有效治疗临床上难以攻破的肝细胞性肝癌。