目的：　　 1．利用分子生物学技术构建HPV16型L2全长基因重组质粒并进行原核表达和鉴定，进一步通过动物免疫及与其它HPV型别间(6、11、16和18型)的交叉反应特性等分析，对HPV16型L2全长原核融合蛋白的免疫原性和抗原性进行了初步研究。　　 2．采用生物信息学软件，对HPV共40种型别的L2氨基酸序列进行同源性分析，筛选出在临床感染常见的HPV6、11、16、18、31、33等14种型别间具有高度保守性的氨基端序列，即HPV L2氨基端(1-200)，并通过分子生物学技术构建并表达该段序列的融合蛋白，经Western blot分析其蛋白在临床最常见HPV感染型别间(6、11、16和18型)的交叉反应特性。　　 3．通过ELISA方法检测分析宫颈癌及尖锐湿疣患者血清中HPV16 L2全长及其氨基端(1-200)的特异性抗体，进一步分析上述两种蛋白作为通用型ELISA抗原试剂，对临床常见HPV型别感染患者血清学诊断的敏感性和特异性。　　 方法：　　 1．采用PCR法从宫颈癌患者组织DNA中扩增HPV16 L2全长基因，将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中，构建重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2，并于L2的C-末端引入6×His标签，以利于蛋白纯化。将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达HPV16 L2蛋白，经SDS-PAGE和Western blot方法鉴定；　　 2．经镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化HPV16 L2全长融合蛋白，经佐剂乳化后，采用背部皮下多点注射免疫日本大耳白家兔，间隔2周免疫，共3次，并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，检测兔免疫血清抗体IgG；进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与HPV16 L2全长蛋白的结合特异性，同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。　　 3．进一步通过WB检测HPV16 L2全长融合蛋白与HPV6、11、16和18型DNA检测阳性的患者血清特异性结合能力。收集108例尖锐湿疣患者、156例宫颈癌患者和100例健康对照者血清，以Ni-NTA Agarose纯化的HPV16 L2全长融合蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA法检测标本中的HPV血清特异性IgG抗体，并分析了该蛋白在检测HPV感染的宫颈癌及尖锐湿疣患者血清特异性抗体的敏感性和特异性。　　 4．采用DNASTAR软件，对HPV共40种型别的L2氨基酸序列进行同源性分析，筛选出临床常见的HPV6、11、16、18、31、33等14种型别间具有高度保守性的L2氨基端(1-200)，并通过分子生物学技术构建和表达该段序列的原核融合蛋白，并经SDS-PAGE和WB方法鉴定。　　 5．采用WB方法分析(1-200)原核蛋白在临床最常见HPV感染型别(6、11、16、18型)间的交叉反应特性；同时收集98例尖锐湿疣患者、135例宫颈癌患者和96例健康对照者血清，通过ELISA．方法检测标本中的HPV血清特异性IgG抗体，并分析该蛋白在检测HPV感染的宫颈癌及尖锐湿疣患者血清特异性抗体的敏感性和特异性。　　 结果：　　 1．成功构建了重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2，并较高效地表达了含有HPV16L2全长基因的原核融合蛋白，其表达量占总蛋白的27．2％；SDS-PAGE和WB检测结果显示在相对分子质量约82x103Da处可见特异性阳性信号条带。　　 2．采用HPV16 L2全长融合蛋白免疫家兔，在全程免疫后产生了高效价的HPV16 L2特异性抗体，最高滴度达1：256000。通过WB检测该抗体可与HPV16 L2融合蛋白在相对分子质量约82x103Da处可见特异性阳性信号条带。　　 3．以HPV6、11、16和18 DNA阳性患者血清为一抗的WB结果显示，HPV16 L2全长融合蛋白在相对分子质量82x103Da处均出现特异性阳性信号条带。ELISA结果显示，尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清抗体吸光度值(A)分别为0．825±0．409、0．808±0．376、0．128±0．15，阳性率分别为92．6％、92．3％和6．0％。3组间血清抗体A值及阳性率差异均具有统计学意义(H=207．292，x2=251．846，P均<0．01)，而尖锐湿疣组与宫颈癌组比较无显著性差异(P>0．05)。基于该蛋白的ELISA用于检测尖锐湿疣组敏感度为92．6％(100/108)，特异度为94．0％(94/100)，对于宫颈癌组诊断的敏感度为92．3％(144/156)，特异度为94．0％(94/100)。　　 4．采用DNASTAR软件，对HPV共40种型别的L2氨基酸序列进行比对分析，进而筛选出在HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52、58、59、66、68、73型别间均具有较高同源性的氨基酸区域，即HPV L2 N端1-200氨基酸序列，上述各型间L2的1-200序列氨基酸与HPV16型相比一致性达52．7％~74．3％。通过分子生物学技术成功构建并表达了含有HPV16 L2氨基端(1-200)氨基酸序列的融合蛋白。　　 5．经WB分析HPV16 L2(1-200)融合蛋白在临床最常见HPV6、11、16、18感染型别间具有良好的交叉识别特性。ELISA结果显示，该蛋白在检测尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清IgG抗体值分别为(0．753±0．262)、(0．756±0．274)和(0．158±0．124)，三组间的A值比较具有显著性差异(H=216．351，P<0.01)，而尖锐湿疣组与宫颈癌组比较无显著性差异(P>0．05)；三组的血清抗体阳性率分别为89．8％(88/98)、88．9％(120/135)和9．3％(9/96)，三组间血清抗体阳性率比较具有显著性差别(x2=193．302，P<0．01)，而尖锐湿疣组与宫颈癌组比较无显著性差异(P>0．05)。基于该蛋白的ELISA血清学抗体检测，对尖锐湿疣诊断的敏感性为89．7％(88/98)，特异性为90．6％(87/96)，对宫颈癌组诊断的敏感性为88．8％(120/135)，特异性为90．6％(87/96)。　　 结论：　　 1．采用PGEX-4T-1表达载体成功构建并表达了未经密码子优化的HPV16 L2全长基因的融合蛋白；可通过亲和层析法纯化了引入6×His标签的HPV16L2融合蛋白，同时经过WB和ELISA检测结果提示该蛋白的抗原性未受影响。　　 2．通过原核HPV16 L2全长蛋白抗原免疫家兔，可成功制备高效价的特异性血清抗体，为HPV L2抗原的免疫学的初步研究提供了实验基础。　　 3．经WB结果提示，HPV16 L2全长蛋白可在临床常见高危型和低危型别即HPV16、18和6、11这4个型别间产生交叉识别反应。经ELISA检测提示，该蛋白作为ELISA诊断试剂抗原在检测尖锐湿疣及宫颈癌患者血清HPV特异性抗体中均具有较高的敏感性和特异性。　　 4．采用生物信息学方法，获得了具有较高保守性的HPV L2氨基端(1-200)的氨基酸序列，该段序列在临床常见HPV型别间(HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52、58、59、66、68、73型)具有较高的同源性。通过原核表达载体PGEX-4T-1可以较高效地表达HPV16 L2(1-200)氨基酸序列。　　 5．WB结果表明HPV16 L2(1-200)融合蛋白在临床最常见HPV6、11、16、18型别的感染血清中具有良好的交叉反应。ELISA结果显示，该蛋白作为ELISA诊断试剂抗原在检测尖锐湿疣及宫颈癌患者血清HPV特异性抗体中均具有较高的敏感性和特异性。