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目的:研究脂多糖(LPS)和血小板活化因子(PAF)诱导急性肺损伤(ALI)机制及G蛋白偶联受体激酶(GRKs)对其调控作用,通过观察LPS、PAF诱导大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)损伤时单层通透系数(Kf)和F-肌动蛋白(F-actin)的变化,以探讨F-actin在RPMVEC损伤时的作用,并通过观察GRKs的变化对Kf和F-actin的影响,以了解GRKs在炎症诱导细胞损伤过程中的调控作用。 方法:在体外分离、培养RPMVEC的基础上,观察不同浓度的LPS、PAF作用RPMVEC不同时相点细胞脱落的情况、HE染色后细胞形态学变化、细胞单层通透性和F-actin的变化,及山莨菪碱、佛波酯(PMA)、灯盏花素的干预作用。采用针头式滤器检测细胞单层通透性,并用流式细胞仪定量检测FITC标记F-actin,采用Western blot观察RPMVEC是否表达GRK2,以及LPS、PAF作用RPMVEC不同时间和山莨菪碱、佛波酯、灯盏花素干预后GRK2的变化。 结果:1 成功体外分离培养RPMVEC,并观察到LPS 1μg/ml作用48h、10μg/ml作用12h、100μg/ml作用8h可见细胞脱落和破裂,100ng/ml作用48h仍未见有细胞脱落或破裂,PAF100ng/ml作用48h、1ug/ml作用24h、10ug/ml作用8h、50ug/ml作用30min可见细胞脱落和破裂。HE染色见LPS组、PAF组(剂量分别为10μg/ml LPS、10μg/ml PAF处理12h),细胞数目较正常组减少,细胞多呈梭形,部分细胞胞体缩小,核浓缩。两组分别加10μg/ml山莨菪碱、50ng/ml佛波酯、50ug/ml灯盏花素(以下各组所加剂量分别与本组相同)后可见:LPS+山莨菪碱组、LPS+佛波酯组、PAF+山莨菪碱组、PAF+佛波酯组、PAF+灯盏花素组细胞数较LPS和PAF组多,细胞形态及细胞核分裂像变化不大,胞浆较丰富,LPS+灯盏花素组较LPS组无明显差别。2 10μg/ml LPS分别作用15、30、60、90、120min,RPMVEC单层的Kf值较对照组显著增高,山莨菪碱组和佛安徽医科大学硕士学位论文波酷组各时相点Kf值显著低于LPS组,灯盏花素组各时相点Kf值与LPS组比较,无显著差异;10林g/ml pAF组30·60·90·12Omin Kf值较对照组显著增高,山蓖蓉碱组各时相点Kf值显著低于PAF组,佛波醋组30、60、gomin Kf值显著低于PAF组,灯盏花素组60、90、120min Kf值显著低于pAF组。3 10协g/ml LpS作用RpMVEC 30min、60min、gomin,F一aetin值较对照组显著降低,山蓑若碱组和灯盏花素组gominF一actin值与LPS组相比,无显著差异,佛波酷组90minF一aCtin值显著高于LPS组。lug/m1LPS作用即MVEC gominF一actin值较对照组显著降低,而山食若碱和灯盏花素可抑制lug/m1LpS作用细胞引起的F一aetin降低。1009/ml pAF组作用即MVEC 3omin、60min、90min、12OminF一aetin值较对照组显著降低,山蓑若碱组、佛波酷组、灯盏花素组90minF一aetin值均显著高于PAF组。4 Western一blot检测RPMVEC表达GRKZ;用10“g/ml LpS刺激即MVEC 3omin、6omin、90Inin与正常对照组相比GRKZ表达明显增高;佛波酷30min组、90min组与LPS 30min组、90min组相比GRKZ表达明显增高,组间比较有显著差异;山蓑若碱gomin组、灯盏花素 gomin组与LPS 90min组相比两者之间无差异。用10协g/ml pAF刺激RpMVEC 3omin、60min·90min与正常对照组相比GRKZ表达明显增高;山蓑若碱90min组与PAF 90min组之间无差异;佛波酷30min,90min组与PAF 30min,90min组相比明显增高;灯盏花素90min组与PAF 90min组相比显著增高。 结论:1成功进行原代培养RPMVEC,鉴定确定为RPMVEC,并观察到LPS、PAF作用于即MVEC可引起细胞脱落及细胞形态学改变。2 LPS、PAF作用于即MVEC可引起F一actin的解聚和单层通透性的增高。3 LPS、PAF作用RPMVEC不同时相点可引起细胞GRKZ表达增高。4山食若碱可抑制LPs、PAF引起的RPMVEC单层通透性增高及PAF、lug/ml LPS引起的RPMVECF一actin下降,对PAF、LPS作用RPMVEC引起的GRKZ表达增高无影响。5小剂量PMA可抑制LPS、以F作用RPMVEC单层通透性的增高和F一aCtin的下降,且可引起LPS、PAF作用RPMVEC的GRKZ表达明显增高。6灯盏花素可抑制PAF作用RPMVEC单层通透性增高和F一actin下降,并能促进PAF作用RPMVECGRKZ表达的进一步增高,灯盏花素对1009/ml LPS作用于即MVEC的上述各环节无影响,却可抑制lug/m1LPS作用细胞引起的F一aCtin下降。7 RPMVEC的F一aetin的解安徽医科大学硕士学位论文聚可能是RPMVEC单层通透性的增高的原因之一,GRKZ的表达增高可抑制LPS、以F诱导RPMVEC损伤。