卵巢具有生殖和内分泌功能,其功能失调是造成女性生殖能力降低的重要原因。在社会和医源性因素的综合作用下我国女性不孕症发病率逐年上升,目前已达10%~15%,严重影响了女性的身体健康和家庭幸福。以体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术为代表的辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)是目前解决不孕问题的重要手段之一,然而优质卵母细胞的缺乏导致IVF-ET技术仍难以摆脱高流产率,低妊娠率的困境。在哺乳动物(包括人)的卵巢内,腔前卵泡是卵泡储备库的基本组成单位,维系着雌性哺乳动物和女性的生殖寿命。虽然其数量众多,但是随着个体发育,99%以上的腔前卵泡发生闭锁退化,只有极少数能发育成熟并排出,无疑造成了生殖资源的巨大浪费。因此,了解腔前卵泡的生长发育机制,以充分开发和利用这一资源具有广泛而深远的医学价值。卵母细胞质量受多种因素影响,随着分子生物学和基因工程技术的不断发展,人们对卵泡发育调节机理的认识不断深化,卵巢局部多因子调节网络尤其是卵母细胞分泌因子(oocyte-secreted factors,OSFs)的提出对传统的下丘脑-垂体-卵巢轴调控卵泡发育的理论形成了巨大挑战,成为生殖医学研究者关注的焦点。其中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)15和BMP6是重要的OSFs,在卵泡生长、优势卵泡选择、卵丘扩张、排卵、黄体形成、卵泡闭锁等诸多方面发挥了重要作用。二者生物学功能的发挥主要通过Smads(drosophila mothers against decapentaplegic proteins)信号转导通路实现,即首先与Ⅱ型受体结合,然后募集Ⅰ型受体,活化的Ⅰ型受体作用于细胞内受体调节型Smads(receptor-regulated Smads,R-Smads)并将其磷酸化,在共同介导型Smad(common-mediator Smad,Co-Smad)的协同下转移至细胞核调控相关靶基因转录。近年来,中医药在促进卵泡发育,提高卵母细胞质量方面的作用日益突出。本课题组前期在补肾调经方、逍遥散对IVF-ET患者颗粒细胞和卵泡液中OSFs以及妊娠结局影响的比较研究中发现,补肾法、疏肝法均可以增加IVF-ET患者获卵数,提高优胚率,改善妊娠率,但两法的作用途径不尽相同,补肾法通过上调颗粒细胞中BMP15和BMP6、卵泡液中BMP6表达来发挥作用,而疏肝法通过上调颗粒细胞中BMP15表达来发挥功能;并进一步以OSFs及其Smads信号通路为切入点对补肾调经方、逍遥散(丸)提高IVF-ET患者和控制性超排卵小鼠卵母细胞质量的机制进行了研究,证实补肾法、疏肝法提高卵母细胞质量作用的发挥与调控IVF-ET患者颗粒细胞和超排卵小鼠卵母细胞中BMP15/BMP6-Smads信号通路有一定的关系,且具体作用环节不尽相同。然而并未对卵泡发育过程中的卵母细胞以及相关信号通路的下游靶基因进行更为深入的探讨。原代细胞培养可以最大程度地保持细胞的初始特性,离体腔前卵泡体外培养体系是研究中药作用机制的良好载体,本研究以补肾调经方作为补肾法的代表方,逍遥丸作为疏肝法的代表方,在前期研究的基础上,进一步观察补肾调经方、逍遥丸含药血清对体外培养小鼠腔前卵泡卵母细胞BMP15/BMP6-Smads-精卵发生特异性的碱性螺旋-环-螺旋转录因子2(spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix transcription factor 2,sohlh2)信号通路中的主要效应分子的影响,以探究BMP15/BMP6-Smads信号通路的可能下游靶基因,阐释两法提高体外发育腔前卵泡卵母细胞质量的可能分子生物学机制,比较两法具体作用位点有何异同,从而完善中医生殖理论,并为优化卵泡体外培养体系以及ART发展提供科学依据。第一部分补肾法、疏肝法对体外培养小鼠腔前卵泡成活率及卵泡直径影响的比较目的:观察补肾调经方、逍遥丸含药血清对体外培养第6天(the sixth day,D6)小鼠腔前卵泡成活率和卵泡直径的影响,探讨两方对腔前卵泡体外发育的调节作用。方法:大鼠含药血清制备:28只6周龄健康雌性SD大鼠随机数字表法随机分为7组:补肾低剂量组、补肾中剂量组、补肾高剂量组、疏肝低剂量组、疏肝中剂量组、疏肝高剂量组和空白对照组,每组4只。分别灌服1.54g/ml、3.08g/ml、4.62g/ml补肾调经方浓缩口服液,0.09g/ml、0.18g/ml、0.27g/ml逍遥丸混悬液和蒸馏水,每日两次,1ml/(100g·d),连续3日。第4日禁食12h后一次性灌服全天剂量,1h后10%水合氯醛腹腔注射麻醉,股动脉取血。37℃水浴15min,常温下3000转/分钟(revolution per minute,rpm)离心15min,取上清,56℃水浴30min,同组血清混匀,过滤除菌、分装,得补肾调经方低、中、高剂量大鼠含药血清,逍遥丸低、中、高剂量大鼠含药血清以及正常大鼠血清。腔前卵泡分离:采用机械显微分离法。24只12日龄昆明小鼠分批颈椎脱臼法处死,无菌条件下迅速取出双侧卵巢,用含青霉素200IU/ml、链霉素200μg/ml的生理盐水清洗2~3次后置于工作液中,转移至超净工作台,40倍体视显微镜下用25G的针头划开卵巢,分离卵泡,注意保持卵泡基底膜的完整性。腔前卵泡分组培养:采用改良的普通培养法群体培养。选择形态规则完整,直径在80~120μm之间的腔前卵泡移入装有培养液的35mm培养皿中,培养液于培养箱中预先平衡过夜,37℃、5%CO2、100%湿度培养于三气培养箱。卵泡贴壁后分别以10%正常大鼠血清、10%补肾调经方大鼠含药血清和10%逍遥丸大鼠含药血清孵育,分为正常组、补肾组、疏肝组,不加大鼠血清为空白组,其中补肾组和疏肝组分别设置低、中、高三个剂量组。体外培养6天。每日倒置显微镜下观察卵泡形态结构变化,D6计数存活卵泡数量,测量卵泡直径。结果:1各组卵泡形态结构变化D2各组卵泡固定在培养皿底,不能移动,卵母细胞清晰可见;D4卵泡增大,颗粒细胞数目明显增多,培养皿底平铺一层细胞;D6颗粒细胞层数增多,越过基底膜生长,难以清晰观察到卵母细胞,卵泡呈“煎蛋样”生长。2各组卵泡成活率比较空白组、正常组、补肾低中剂量组、疏肝低中剂量组之间卵泡成活率无统计学差异(P>0.05),补肾高剂量组、疏肝高剂量组升高(P<0.05),且补肾高剂量组高于疏肝高剂量组(P<0.05)。3各组卵泡直径比较空白组与正常组卵泡直径无统计学差异(P>0.05),各用药组增大(P<0.05)。补肾组组内比较,补肾高剂量组最大,补肾中剂量组次之,补肾低剂量组最小(P<0.05),呈剂量依赖性;疏肝组组内比较,疏肝高剂量组大于疏肝中低剂量组(P<0.05),疏肝中低剂量组之间无统计学差异(P>0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,补肾高剂量组大于疏肝高中低剂量组(P<0.05),补肾中剂量组大于疏肝中低剂量组(P<0.05),补肾低剂量组与疏肝低剂量组无统计学差异(P>0.05)。小结:补肾法、疏肝法均可以提高体外培养腔前卵泡成活率,增大卵泡直径,促进体外卵泡发育,且补肾法优于疏肝法。第二部分补肾法、疏肝法对体外培养过程中小鼠腔前卵泡卵母细胞BMP15、BMP6影响的比较目的:观察补肾调经方、逍遥丸含药血清对体外培养过程中小鼠腔前卵泡卵母细胞BMP15、BMP6的影响,探讨两方提高体外培养卵泡卵母细胞质量与调控BMP15、BMP6表达的关系。方法:腔前卵泡分离、分组培养同第一部分。卵母细胞收集:采用酶消化法。分别于D2、D4、D6体视显微镜下使卵泡悬浮,离心后依次用0.25%胶原酶NB4和0.1%透明质酸酶37℃消化腔前卵泡5~10min,消化过程中间断性轻轻吹打,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)反复漂洗后得到卵母细胞。分别用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测BMP15、BMP6信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA),细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)和流式液相多重蛋白定量技术(cytometric bead array,CBA)检测BMP15、BMP6蛋白表达。结果:1体外培养D2各组卵母细胞BMP15、BMP6 m RNA和蛋白表达比较与空白组比较,正常组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均无统计学差异(P>0.05),各用药组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均升高(P<0.05)。补肾组和疏肝组各自组内比较,BMP15 m RNA和蛋白、BMP6 m RNA均以高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05),BMP6蛋白补肾组呈剂量依赖性(P<0.05),疏肝组中疏肝高剂量组高于疏肝中低剂量组(P<0.05),疏肝中低剂量组之间无统计学差异(P>0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,补肾高剂量组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均高于疏肝高中低剂量组(P<0.05);补肾中剂量组BMP15 m RNA、BMP6 m RNA和蛋白均高于疏肝中低剂量组(P<0.05),补肾中剂量组BMP15蛋白与疏肝中剂量组无统计学差异(P>0.05),高于疏肝低剂量组(P<0.05);补肾低剂量组BMP15 m RNA高于疏肝低剂量组(P<0.05),补肾低剂量组与疏肝低剂量组BMP15蛋白、BMP6 m RNA和蛋白无统计学差异(P>0.05)。2体外培养D4各组卵母细胞BMP15、BMP6 m RNA和蛋白表达比较与空白组比较,正常组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均无统计学差异(P>0.05),各用药组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均升高(P<0.05)。补肾组组内比较,BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均以补肾高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05);疏肝组组内比较,BMP15 m RNA和蛋白疏肝高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05),BMP6 m RNA和蛋白疏肝高剂量组高于疏肝中低剂量组(P<0.05),疏肝中低剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,补肾高剂量组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均高于疏肝高中低剂量组(P<0.05);补肾中剂量组BMP15 m RNA和蛋白与疏肝中剂量组无统计学差异(P>0.05),高于疏肝低剂量组(P<0.05),补肾中剂量组BMP6 m RNA和蛋白高于疏肝中低剂量组(P<0.05);补肾低剂量组BMP15 m RNA高于疏肝低剂量组(P<0.05),补肾低剂量组BMP15蛋白、BMP6 m RNA和蛋白与疏肝低剂量组无统计学差异(P>0.05)。3体外培养D6各组卵母细胞BMP15、BMP6 m RNA和蛋白表达比较与空白组比较,正常组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均无统计学差异(P>0.05),各用药组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均升高(P<0.05)。补肾组组内比较,BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均以补肾高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05);疏肝组组内比较,疏肝高剂量组BMP15 m RNA和蛋白与疏肝中剂量无统计学差异(P>0.05),高于疏肝低剂量组(P<0.05),BMP6 m RNA和蛋白疏肝高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,补肾高剂量组BMP15、BMP6 m RNA和蛋白均高于疏肝高中低剂量组(P<0.05);补肾中剂量组BMP15、BMP6m RNA和蛋白均高于疏肝中低剂量组(P<0.05);补肾低剂量组BMP15m RNA和蛋白与疏肝低剂量组无统计学差异(P>0.05),补肾低剂量组BMP6 m RNA和蛋白高于疏肝低剂量组(P<0.05)。4各组卵母细胞不同时间点BMP15、BMP6 m RNA和蛋白表达的比较BMP15 m RNA和蛋白,空白组和正常组D2、D4、D6有逐渐升高趋势,但无统计学意义(P>0.05),补肾低中剂量组和疏肝低中剂量组D4与D2无统计学差异(P>0.05),D6较D4、D2升高(P<0.05),补肾高剂量组D4较D2升高(P<0.05),D6较D4升高(P<0.05),疏肝高剂量组D4较D2升高(P<0.05),D6与D4无统计学差异(P>0.05);BMP6 m RNA和蛋白,空白组和正常组D2、D4、D6有逐渐升高趋势,但无统计学意义(P>0.05),补肾组D4较D2升高(P<0.05),D6较D4升高(P<0.05),疏肝组中疏肝低中剂量组D4与D2无统计学差异(P>0.05),D6较D4、D2升高(P<0.05),疏肝高剂量组D4较D2升高(P<0.05),D6与D4无统计学差异(P>0.05)。小结:补肾法、疏肝法可能通过上调体外培养过程中腔前卵泡卵母细胞BMP15、BMP6基因和蛋白表达水平发挥提高卵母细胞质量的作用,随培养时间延长两法作用更为明显,且补肾法优于疏肝法。第三部分补肾法、疏肝法对体外培养小鼠腔前卵泡卵母细胞BMP15、BMP6膜受体及Smads信号分子影响的比较目的:观察补肾调经方、逍遥丸含药血清对体外培养D6小鼠腔前卵泡卵母细胞中激活素受体样激酶(activin receptor-like kinase,ALK)2、ALK6、骨形态发生蛋白受体Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor,BMPRⅡ)、Smad1、Smad5、Smad8、p-Smad1/5/8的影响,分析两方提高体外卵母细胞质量的可能机制。方法:腔前卵泡分离、培养方法同第一部分。实验分组:选取合适的腔前卵泡随机分为空白组、正常组、补肾组、疏肝组、抑制剂组,空白组不加大鼠血清,其余各组分别加入10%正常大鼠血清、10%补肾调经方大鼠含药血清、10%逍遥丸大鼠含药血清、10%高剂量大鼠含药血清+10μmol/L K02288,其中补肾组和疏肝组分别设置低、中、高三个剂量组,抑制剂组设置补肾抑制剂组和疏肝抑制剂组。卵母细胞收集:抑制剂组在细胞收集前以K02288孵育2h,之后操作与其它组相同,具体流程同第二部分。实时荧光定量PCR检测ALK2、ALK6、BMPRⅡ、Smad1、Smad5、Smad8 m RNA,细胞免疫荧光检测上述指标和p-Smad1/5/8蛋白表达,流式液相多重蛋白定量技术检测ALK2、ALK6、BMPRⅡ、Smad1、Smad5蛋白表达。结果:1各组卵母细胞ALK2、ALK6 m RNA和蛋白表达比较与空白组比较,正常组ALK2、ALK6 m RNA和蛋白均无统计学差异(P>0.05),补肾组和疏肝组ALK2、ALK6 m RNA和蛋白均升高(P<0.05)。补肾组和疏肝组各自组内比较,ALK2、ALK6 m RNA和蛋白均以高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,补肾高剂量组ALK2、ALK6 m RNA和蛋白均高于疏肝高中低剂量组(P<0.05);补肾中剂量组ALK2、ALK6 m RNA和蛋白均高于疏肝中低剂量组(P<0.05);补肾低剂量组ALK2 m RNA和蛋白高于疏肝低剂量组(P<0.05),补肾低剂量组ALK6 m RNA和蛋白与疏肝低剂量组无统计学差异(P>0.05)。2各组卵母细胞BMPRⅡm RNA和蛋白表达比较与空白组比较,正常组BMPRⅡm RNA和蛋白无统计学差异(P>0.05),补肾组和疏肝组BMPRⅡm RNA和蛋白升高(P<0.05)。补肾组和疏肝组各自组内比较,BMPRⅡm RNA和蛋白均以高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,疏肝高剂量组BMPRⅡm RNA和蛋白高于补肾高中低剂量组(P<0.05);疏肝中剂量组高于补肾中低剂量组(P<0.05);疏肝低剂量组高于补肾低剂量组(P<0.05)。3各组卵母细胞Smad1、Smad5、Smad8 m RNA和蛋白表达比较Smad1 m RNA和蛋白:空白组、正常组、补肾低剂量组、疏肝低中剂量组之间均无统计学差异(P>0.05),补肾中高剂量组、疏肝高剂量组升高,其中补肾高剂量组与疏肝高剂量组无统计学差异(P>0.05),高于补肾中剂量组(P<0.05)。Smad5、Smad8 m RNA和蛋白:与空白组比较,正常组Smad5、Smad8m RNA和蛋白均无统计学差异(P>0.05),补肾组和疏肝组Smad5、Smad8m RNA和蛋白均升高(P<0.05)。补肾组组内比较,Smad5 m RNA和蛋白补肾高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05),Smad8 m RNA和蛋白补肾高剂量组与补肾中剂量组无统计学差异(P>0.05),高于补肾低剂量组(P<0.05);疏肝组组内比较,Smad5 m RNA和蛋白疏肝高剂量组与疏肝中剂量组无统计学差异(P>0.05),高于疏肝低剂量组(P<0.05),Smad8 m RNA和蛋白疏肝高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,Smad5 m RNA和蛋白疏肝高剂量组与补肾高剂量组无统计学差异(P>0.05),高于补肾中低剂量组(P<0.05),疏肝中剂量组高于补肾中低剂量组(P<0.05),疏肝低剂量组高于补肾低剂量组(P<0.05);Smad8 m RNA和蛋白补肾高剂量组高于疏肝高中低剂量组(P<0.05),补肾中剂量组高于疏肝中低剂量组(P<0.05),补肾低剂量组高于疏肝低剂量组(P<0.05)。4各组卵母细胞p-Smad1/5/8蛋白表达比较与空白组比较,正常组p-Smad1/5/8蛋白无统计学差异(P>0.05),补肾组和疏肝组升高(P<0.05)。补肾组和疏肝组各自组内比较,p-Smad1/5/8蛋白均以高剂量组最高,呈剂量依赖性(P<0.05)。补肾组和疏肝组组间比较,补肾高剂量组p-Smad1/5/8蛋白高于疏肝高中低剂量组(P<0.05),补肾中剂量组高于疏肝中低剂量组(P<0.05),补肾低剂量组高于疏肝低剂量组(P<0.05)。分别与补肾高剂量组、疏肝高剂量组比较,补肾抑制剂组、疏肝抑制剂组p-Smad1/5/8蛋白均降低(P<0.05)。小结:补肾法、疏肝法可能通过增加ALK2、ALK6、BMPRⅡ、Smad1、Smad5、Smad8基因和蛋白表达、p-Smad1/5/8蛋白表达,上调Ⅰ型受体的磷酸化作用,增强BMP15/BMP6-Smads信号传导,从而提高体外培养小鼠腔前卵泡卵母细胞质量。并且在上调Ⅰ型受体、Smad1、Smad8和p-Smad1/5/8方面补肾法优于疏肝法,上调Ⅱ型受体和Smad5方面疏肝法优于补肾法。第四部分补肾法、疏肝法对体外培养小鼠腔前卵泡卵母细胞sohlh2影响的比较目的:观察补肾调经方、逍遥丸含药血清对体外培养D6小鼠腔前卵泡卵母细胞sohlh2的影响,探究两方提高卵母细胞质量机制的可能靶点。方法:腔前卵泡分离、培养方法同第一部分,实验分组、卵母细胞收集同第三部分。实时荧光定量PCR检测sohlh2 m RNA,细胞免疫荧光检测sohlh2蛋白表达。结果:空白组、正常组、补肾低剂量组、疏肝中低剂量组sohlh2 mRNA和蛋白均无统计学差异(P>0.05),补肾中高剂量组、疏肝高剂量组升高(P<0.05),由高到低依次为补肾高剂量组、补肾中剂量组、疏肝高剂量组(P<0.05)。分别与补肾高剂量组、疏肝高剂量组比较,补肾抑制剂组、疏肝抑制剂组sohlh2 m RNA和蛋白均降低(P<0.05)。小结:sohlh2可能是补肾法、疏肝法调控BMP15/BMP6-Smads信号传导的靶基因,且补肾法上调sohlh2表达的作用优于疏肝法。结论:补肾法、疏肝法可能通过调控体外发育腔前卵泡卵母细胞中BMP15/BMP6-Smads-sohlh2信号转导通路,促进体外卵泡发育,提高卵母细胞质量,具体机制是:诱导BMP15和BMP6与Ⅱ型受体BMPRⅡ结合,分别募集BMP15的Ⅰ型受体ALK6、BMP6的Ⅰ型受体ALK2和ALK6,增强Ⅰ型受体的磷酸化作用,进而将受体后信号分子Smad1、Smad5、Smad8磷酸化为p-Smad1/5/8,作用于下游靶基因sohlh2,发挥生物学效应。在上调BMP15、BMP6、Smad1、Smad8、p-Smad1/5/8、sohlh2表达方面补肾法优于疏肝法,上调Smad5表达方面疏肝法优于补肾法,补肾法主要作用于Ⅰ型受体,而疏肝法主要作用于Ⅱ型受体。