大肠癌(Colorectal adenocarcinoma, CRC)是人类消化系统最常见且主要的致死性肿瘤之一。大肠癌是一个多基因、多阶段、长期形成的复杂的病变过程。早发现、早诊断、早治疗对提高结直肠癌的存活率有显著的意义。因此,探索大肠癌早期病变及其演进过程中的分子机制显得尤为重要。近来,微小RNA(microRNA,miRNA)由于其在调控基因表达方面的重要作用,成为关注的焦点。microRNA (miRNA)是一类长度在18-25个核苷酸的内源性非编码的单链RNA分子,通过与靶基因的mRNA3’UTR区域配对调控基因的表达进而发挥生物学功能。研究表明,miRNAs广泛存表达于各个物种和组织中,并参与调节细胞生长发育、分化、凋亡并影响肿瘤的生长。一些研究证实miRNA具有癌基因或抑癌基因样作用,可直接参与人类肿瘤(如肺癌、乳腺癌、颅脑肿瘤、肝癌、结直肠癌及淋巴瘤等)的形成,是肿瘤发生、发展过程中重要分子。研究表明,在大肠癌中差异表达的miRNA均可通过作用于肿瘤相关的靶基因来调控肿瘤的发生和发展。然而,对于其中绝大部分miRNA,它们作用的靶基因以及具体的生物学功能目前仍有待于进一步研究。本课题组前期研究通过激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection,LCM)及Agilent芯片技术已经对225例大肠肿瘤各个阶段病变标本进行全基因组microRNA表达分析,我们发现有40个miRNA的表达在大肠粘膜上皮转化和演进的过程中存在显著差异。本研究首先筛选和验证出在大肠肿瘤转化和演进过程中与miRNA相关的靶基因,同时我们在临床大肠病变样本中通过原位杂交方法检测miR-424的表达,并进一步验证早期大肠癌中特异性表达的miR-424与目标靶基因的相关关系,探索miR-424的在大肠癌细胞株中的生物学行为,揭示miR-424在大肠癌发生过程中的生物学功能,为大肠癌的早期发生提供分子理论依据,并为其诊断和治疗提供新的靶点。第一部分大肠肿瘤转化和演进过程中与microRNA相关靶基因的初步筛选目的：预测并筛选与大肠肿瘤转化和演进相关作用通路中的候选miRNA的目标靶基因。方法：通过miRecords数据库对上述40个miRNA进行靶基因mRNA的预测(整合了至少4个靶基因预测软件)。结合上述大肠癌信号通路上的关键蛋白,根据KEGG信号通路数据库对靶基因mRNA进一步加以筛选。在59例人冰冻大肠组织中(包括18例正常大肠上皮组织,19例大肠腺瘤组织,22例Dukes’A和Dukes’B期大肠腺癌组织),应用荧光实时定量RT-PCR方法检测上述靶基因mRNA的表达水平及其相应miRNA的表达水平。使用校正t检验和差异倍数超过2倍的筛选条件以miRNA-mRNA表达呈负向关系的规律,筛选进一步待功能研究的靶基因。结果：通过miRecords数据库靶点预测以及KEGG数据库比对后发现,其中27个microRNA的靶基因涉及大肠肿瘤转化和演进过程中关键的信号通路,相关的靶基因共58个。这些mRNA所翻译表达的蛋白主要涉及Wnt、TGF-beta、MAPK、p53等重要信号通路。经qRT-PCR检测发现,20个mRNA的表达在不同组织中存在显著差异(t检验,p<0.05),且其表达从正常肠上皮到腺瘤直至Dukes’A/B期腺癌均呈降低趋势。其中13个mRNA的表达与其相对应的8个miRNA (miR-135b、miR-182、miR-183、miR-34a、miR-424、miR-552、miR-769-5p和miR-96)的芯片表达结果呈负相关。经qRT-PCR进一步验证发现,5个miRNA (miR-135b、miR-182、miR-183、miR-424、和miR-96)与9个mRNA(NODAL、 SMAD4、MET、CYCS、PDGFRA、MAP2K1、SMAD3、MAP2K4和WNT7A)存在负相关关系。并且miR-424的表达水平在肠腺瘤至Dukes’A/B期肠腺癌存在显著差异(p<0.001),上调倍数较其他miRNA高,约为3.12倍。结论：大肠癌信号通路中关键蛋白相对应的mRNA表达在不同阶段病变的大肠组织中存在显著差异,其中一些mRNA的表达与其相对应的miRNA表达呈负相关。miRecords和KEGG数据库为microRNA靶基因的预测提供了很好的途径,在组织水平上可以筛选待进一步功能研究的靶基因。miR-424在肠腺瘤与Dukes’A/B期肠腺癌显著差异表达引起我们的关注。第二部分原位杂交分析miR-424在早期结直肠癌及癌前病变中的表达目的：原位杂交实验检测miR-424在正常肠上皮、肠腺瘤(低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变)与早期大肠癌的表达水平。方法：在30例石蜡包埋结直肠切除手术样本中(包括7例低级别上皮内瘤变组织,8例高级别上皮内瘤变,15例Dukes’A和Dukes’B期大肠腺癌组织及各自旁的正常组织以供对照研究),使用原位杂交方法检测miR-424的表达情况。结合CRi-Nuance多光谱显微影像系统的光谱检测技术和inForm软件,对miR-424在结直肠病例组织中的表达范围、浆阳性强度行定量分析。结果：肠腺瘤和早期大肠癌中miR-424在细胞浆中的平均表达面积比正常肠组织大。Dukes’A/B期大肠癌与癌旁正常组织之间(△=1.16)、高级别上皮内瘤变与旁正常组织之间(A=1.56)、低级别上皮内瘤变与旁正常组织之间(Δ=1.56)以及癌旁正常组织与高级别上皮内瘤变旁正常组织之间(Δ=1.32)等组合中miR-424于细胞浆中的表达范围明显扩大(p<0.05)；Dukes’A/B期大肠癌比癌旁正常组织(Δ=1.63)及低级别上皮内瘤变(A=1.34)；高级别上皮内瘤变比低级别上皮内瘤变(Δ=1.29)中miR-424在细胞浆阳性表达的强度比例升高(p<0.05)。结论：利用多光谱成像系统能有效的定量检测miR-424的杂交信号,并证实miR-424在早期肠腺癌及癌旁组织、早期肠腺癌与低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变之间,以及在高级别上皮内瘤变与早期大肠癌的肿瘤旁正常组织间显示出一定的表达差异,但miR-424在早期肠腺癌与高级别上皮内瘤变之间的表达未见显著差异。第三部分：鉴定miR-424候选靶基因及具体生物学功能目的：细胞水平验证miR-424与其候选靶基因的相互关系,并探讨miR-424在结肠癌DLDl细胞中生物学功能。方法：构建稳定高表达miR-424的人结肠癌DLD1细胞株。运用qRT-PCR,荧光素报告基因检测系统和Western-blot方法检测miR-424直接调控的靶基因。采用CCK8实验、Transwell侵袭及迁移实验检测miR-424对人结肠癌DLD1细胞的生长、侵袭转移能力。结果：荧光素报告基因系统检测结果显示,miR-424能抑制MAP2K1、SMAD3和WNT7A荧光素酶活性。Real-time RT-PCR和Western-blot方法检测结果显示,miR-424能够抑制SMAD3和WNT7A的蛋白表达,但是mRNA水平无明显差异。通过Transwell小室侵袭和迁移实验发现,稳定过表达miR-424的DLD1细胞侵袭和迁移能了均较对照组强,上调miR-424能够促进大肠癌细胞株的侵袭及迁移能力。CCK8实验结果显示上调DLD1细胞中miR-424的表达,对其增殖能力无显著影响。结论：miR-424能直接结合并作用于SMAD33’UTR和WNT7A3’UTR,并且参与SMAD3和WNT7A的蛋白表达的调节。miR-424可促进结肠癌细胞DLD1侵袭与迁移能力。