随着越来越多的物种被成功克隆,哺乳动物核移植技术越来越受到人们的重视。在基础理论研究方面,它可用于研究细胞发育过程中基因的表达规律和调控机理,亦可用于建立稳定的动物模型,利于研究人类疾病的发病机理;在生产实践中,它可用于畜牧业育种、生产可表达特殊医药蛋白的转基因动物,还可用于延缓珍稀濒危动物的灭绝。哺乳动物核移植需要使用大量的卵母细胞做为受核胞质,而从动物体内直接获取卵母细胞不仅难度大、效率低,价格也不菲。从屠宰场废弃卵巢上回收卵母细胞,数量大,价格低,是我们研究哺乳动物核移植的很好来源。在多种动物上,利用屠宰场回收的未成熟卵,经体外培养成熟后,可用于核移植并出生克隆后代,但在兔子上一直没有成功。虽然早在1975年就开始兔子胚胎细胞核移植的研究并获得囊胚,但兔子核移植的研究并不顺利。1988年Stice等人用8细胞胚胎卵裂球做供核细胞,首次出生了6只胚胎细胞核移植克隆兔;直到2002年Chesne等人利用卵丘细胞为供核细胞,才首次成功出生了体细胞克隆兔。兔子之所以如此难以克隆,跟它自身的生理特点有很大关系。目前成功出生的克隆兔子,使用的受核胞质仍然全部来自于体内成熟卵母细胞。为了使用更丰富且廉价的卵母细胞来研究兔子克隆的难点,有必要尽快开展体外成熟卵母细胞用于核移植的研究。本论文详细研究了兔子体外成熟卵母细胞用于核移植的方案。首先我们建立了兔子卵母细胞体外成熟系统。从屠宰场取回卵巢上回收的未成熟卵母细胞,其质量是不一样的。在本实验中,我们比较了不同卵泡内回收卵母细胞的直径、成熟进程和发育能力。我们依直径将卵泡分为4组:(1) <0.5mm; (2) 0.7-1.0mm; (3) 1.0-1.5mm; (4) >1.5mm。经研究发现,不同卵泡直径内的卵母细胞直径不同,随着卵泡直径逐渐增大,卵母细胞直径也逐渐增大。直到卵泡直径达到1mm以上时,卵母细胞直径长足,达到113μm左右。研究GV染色质构型时发现,0.7-1.0mm卵泡卵母细胞LC构型比例达75%,但>1.0mm卵泡卵母细胞则70%处于TC构型。采用M199做为卵母细胞成熟液,获得体外成熟的卵母细胞。不同直径卵泡来源的卵母细胞,其成熟能力和成熟速度略有差异。<0.5mm卵泡内的卵母细胞无法恢复减数分裂,0.7-1.0mm卵泡内的卵母细胞,虽然完全具有了成熟能力,但成熟速度较慢,发育能力较差。>1mm卵泡内的卵母细胞,已经完全具备了胚胎早期发育的能力,体外培养10个小时即可达到最大成熟率96.6±1.7%,孤雌激活后,第六天囊胚率可达55.1±3.2%。目前出生克隆兔子的研究,都采用电激活的方式激活重构胚。本实验采用化学激活的方法,用Ionomycine引发钙波动,并用6-DMAP和CHX抑制MPF/CSF活性。优化条件后,我们得出如下最佳方案:2.5μg/ml的Ionomycine处理5min,2mM的6-DMAP加5μg/ml的CHX联合作用1小时,随后换入含10% FCS的M199中培养。>1mm卵泡内的卵母细胞孤雌激活并体外培养12小时后观察,卵裂率可达81.9±5.0%,6天后观察,囊胚率可达55.1±3.2%,囊胚孵出率可达60.0±5.8%。成熟卵母细胞去核的成败,直接影响胚胎后期能否正常发育。本实验用Demecolcine诱导胞质突起,然后在显微操作仪下,用去核针吸去突起和第一极体,去核率可达100%。低浓度的Demecolcine毒性较小,采用此方法去核的重构胚,经移植后,可成功获得克隆后代。我们的研究发现,卵龄年轻的卵母细胞不容易被诱导出胞质突起。同样用0.6μg/ml的Demecolcine诱导60分钟,IVM12小时的卵母细胞只有32.7%形成胞质突起,IVM14小时的卵母细胞可以达到86.8%,而IVM18小时的卵母细胞,突起率可达90.3%。对于IVM14小时的卵母细胞来说,约有80%的极体与核偏移在10°以内,尚可用盲吸去核;对于IVM18小时的卵母细胞来说,只有65%的极体与核偏移在30°以内了,用盲吸去核的方法已经很难保证去核率了。因此更有必要使用Demecolcine辅助去核。供核细胞所处的细胞周期,关系到供体核进入受核胞质后重编程的效果。目前普遍的做法是将G0/G1期的供体核移入MII期的受核胞质中。我们采取了接触抑制和血清饥饿这两种方法来同步化供核细胞到G0/G1期。经流式细胞仪检测,接触抑制3-5天的处理可以使80%的细胞处于G0/G1期,血清饥饿3-5天则可以达到85%以上。受核胞质的卵龄也是影响核移植成功率的一个重要因素,我们的研究表明,IVM12小时的成熟卵母细胞就可以用作核移植,直到IVM18小时,卵母细胞的质量没有明显下降,均可支持重构胚卵裂率达到80%左右,囊胚率达到30%左右。添加MG132并没有提高囊胚率,反而使囊胚率由26.6%降低到9.2%。但添加MG132后对卵裂影响有限,虽然数值有所降低,但差异并不显著。不同类型的细胞分化程度不同,不同类型的供核细胞克隆效率也是不同的。我们总共采用了3种细胞做为供核细胞。当用耳朵皮肤成纤维细胞作供核细胞时,卵裂率只有78%,囊胚率只有19.7%。采用胎儿皮肤成纤维细胞和卵丘细胞做为供核细胞时,卵裂率没有明显变化,但囊胚率明显升高,可达35%以上。对于兔子来说,受体的发情周期与重构胚发育阶段的配合至关重要。通过人工观察选取处于发情期的受体母兔,用结扎公兔刺激并注射100单位hCG。我们依据已经出生克隆兔子的实验方案,设计了3个移植时间点,但移植后没有获得克隆后代。