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氧化还原酶广泛应用于制药、精细化工品合成以及手性材料的生产等领域,且多数反应的完成需要烟酰胺辅酶NAD(P)H发挥作用。NADPH价格昂贵、重复利用率低,因此,需要构建合适的辅酶再生系统来解决此类问题。其中,甲酸脱氢酶(FDH)再生体系在所构建的酶偶联辅酶再生系统中经济效率最高,而NADP~+依赖型甲酸脱氢酶是构建氧化态辅酶和还原态辅酶体系中的关键酶。因此,研究获取NADP~+依赖型甲酸脱氢酶的方法具有重大的研究意义。本论文拟通过两种方式获取NADP~+依赖型甲酸脱氢酶。第一种方式是利用基因工程技术合成NADP~+依赖型甲酸脱氢酶。实验以洋葱伯克氏霍尔德菌Burkholderia stabilis 15516基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆得到ACF35003.1甲酸脱氢酶基因的全部序列,基因长度1161 bp,编码386个氨基酸。以pET-17b为表达载体构建重组菌pET-17b-FDH,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达。实验设置一系列梯度实验研究产酶的最优条件以及酶学性质,结果表明,重组酶的最适诱导时机为接种后10 h,最佳诱导时长为28 h,IPTG最适浓度为0.5 mM,酶的最适反应温度为30oC,最适反应pH为6.0,最适pH范围6.0-9.0。温度范围在25-30oC时,重组酶对NAD~+比活力受温度影响较小;温度范围在30-37oC时,重组酶对NADP~+比活力受温度影响较小,热稳定性有待提高。第二种方式是收集野生型NADP~+依赖型甲酸脱氢酶。实验以植物根系周围的土壤为研究对象,采用定向筛选培养基TB-T和PCAT收集洋葱伯克氏菌群及近缘种,通过观察菌落形态生长,结合KOH溶液法以及革兰氏染色法,共分离到563株疑似菌。由于传统微生物分离法重复性高、工作量巨大、所需周期较长,相关工作还在进行中。针对上述两种获取NADP~+依赖型甲酸脱氢酶的方式,本实验分别建立了两种有效筛选NADP~+依赖型甲酸脱氢酶的鉴定方法。鉴于野生菌样本数量多、菌种重复率高,采用微量显色筛选法能够快速、准确检测样品。对于重组菌则直接将其粗酶液加入酶活测试体系中,以紫外可见分光光度计测试OD600,计算出酶活。