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金钱槭属(Dipteronia Oliv.)隶属于槭树科(Aceraceae),是我国特有少种属。属下仅包括云南金钱槭(D.dyeriana Henry)、金钱槭(D.sinensis Oliv.)两个种,分别被列为国家二级、三级珍稀濒危保护植物。为了更好地保护我国特有种质资源,本文在广泛收集金钱槭属植物材料的基础上,首次对该属植物进行了保护遗传学和分子亲缘地理学研究。
首先,通过查阅标本、翻阅资料、走访有关专家及对云南、湖北、重庆等9个省市33个代表性地点的野外实地调查,较为全面、系统地报道了金钱槭属植物的生长状况、生存环境、人为干扰等情况,为对该属植物进行全面研究补充了基本资料。
其次,应用RAPD标记技术对金钱槭、云南金钱槭居群的遗传多样性和遗传分化进行了比较研究。利用18条随机引物对17个金钱槭居群的226个个体进行扩增,共检测到128个位点,其中多态位点119个。总多态位点比率(PPB)为92.97%,显示金钱槭具有较高水平的遗传多样性。Shannon多样性指数(0.5563)、Nei基因多样性指数(0.3864)和基因分化系数值(GSt=0.4470)说明,尽管大多数遗传变异仍然存在于居群内,但居群间已产生较高水平的遗传分化。AMOVA分析结果显示,金钱槭居群内遗传变异占总遗传变异量的56.89%,居群间遗传变异占总变异量的43.11%,进一步支持了上述结果。金钱槭居群间的基因流Nm=0.6685,Nm<1.居群间基因交流匮乏。居群间地理距离与遗传距离(经、纬度,海拔)的相关性分析结果显示,遗传距离与经度差异间具有极显著水平的正相关性(P<0.01),聚类分析、主成分分析结果也显示出各聚类群与地理差异存在相关性的趋势。用相同的18条引物对4个云南金钱槭居群的45个个体进行RAPD扩增,共检测到103个位点,其中多态位点84个,云南金钱槭物种水平的多态位点比率为81.55%。AMOVA分析结果揭示,云南金钱槭居群内遗传变异占总变异量的57.86%,居群间遗传变异占总变异量的42.14%,与基因分化系数(GST=0.4267)分析结果基本一致。云南金钱槭居群间的基因流Nm=0,6719,Nm<1,居群间基因交流十分有限。居群间遗传距离与地理隔离的相关性分析结果显示,云南金钱槭居群间遗传距离与地理隔离不存在显著的相关性。对金钱槭、云南金钱槭居群遗传多样性及遗传分化进行比较发现:1)金钱槭的遗传多样性水平高于云南金钱槭,符合广布种的遗传多样性高于狭域种这一规律。2)金钱槭、云南金钱槭居群间的遗传分化均已达到较高水平,居群间的基因流匮乏。3)在大尺度上(金钱槭)遗传距离与地理距离有相关性而在小范围内(云南金钱槭)则无上述关系,这可能与位于不同分布区内的物种所承受的生境选择压力不同有关。
第三,通过测量27项果实、种子、枝叶的宏观、微观形态学性状,揭示了云南金钱槭的形态变异模式。同时结合遗传变异及生态因子资料,分析了云南金钱槭形态变异的产生、维持机制。形态学性状分析结果表明:1)各居群形态性状变异系数平均值从大到小的排列顺序为:文山居群>屏边居群>黑龙潭居群>蒙自居群。2)在27个性状中,有4个性状在居群间的差异达显著性水平(P<0.05),15个达极显著水平(P<0.01)。果实长度在居群间的变异最大,小叶叶长/叶柄长在居群间的变异最小。3)文山居群与屏边、黑龙潭、蒙自居群间已产生显著或极显著水平的形态差异,而后三者间的差异未达显著水平。形态变异与遗传变异、生态因子间的相关分析结果显示:1)形态性状变异系数与多态位点比率、Shannon多样性指数及Nei基因多样性指数间存在着正相关关系,但相关性均未达显著水平。2)形态变异与生态因子间存在较复杂的相关性,海拔、土壤含水量等6个生念因子与一些形态性状的相关性已达显著或极显著水平。相对于其它生态因子来说,海拔对形念性状变异的影响最大。上述结果说明,云南会钱槭的形态变异虽然具有一定的遗传基础,但可塑性及环境压力对形态变异所产生的作用更大一些。基于形态性状和RAPD数据的聚类分析结果进一步说明,云南金钱槭的形态变异受到环境因子的强烈影响而与遗传背景的关系不显著。
第四,本文采用PCR-RFLP技术对金钱槭属植物进行了分子亲缘地理学研究。选取7对叶绿体DNA通用引物对来自17个金钱槭居群、4个云南金钱槭居群的63个个体进行PCR扩增,扩增产物用HaeⅢ、FunDⅡ等四种4碱基内切酶和EcoRⅠ+RsaⅠ、HindⅢ+Hin6Ⅰ两种4、6碱基限制性内切酶组合进行酶切。42种引物/酶组合在云南金钱槭中共检测到109个DNA片段,所有片段均为单态,在金钱槭中共检测到124个片段,其中多态片段20个,多态片段占总片段数量的16.13%。分析所有酶切片段,发现了6种cpDNA单倍型,其中云南金钱槭独享一种单倍型,金钱槭具有另外5种单倍型。金钱槭的5种单倍型具有明显的地理分化,根据单倍型的地理分布格局和所属山系,将所研究的金钱槭居群划分为4个地理单元:秦岭地理单元、武陵山地理单元、岷山地理单元和大巴山地理单元。通过AMOVA软件计算得到4个地理分布单元间的分化系数(GST)值为0.9299,即有92.99%的遗传变异存在于地理分布单元间,7.01%的遗传变异存在于地理单元内,说明金钱槭cpDNA变异主要发生在地理单元间,而地理单元内的遗传变异较少。基于GST值,计算地理分布单元间cpDNA基因流仅为0.0377,地理单元间的遗传分化水平十分显著。在众多影响种内遗传变异分布格局的因素中,第四纪冰川可能是一个重要的影响因子,冰川来临时动植物物种有一系列向赤道方向迁移、压缩并在避难所中躲避恶劣气候的现象,随着冰川的消退和温度的回升,幸存生物的分布范围开始重新扩展。我国的第四纪冰川属于山岳冰川,冰川活动被限制在局部地区,形成了较多的冰期避难所。根据第四纪环境、植被变化特点,结合金钱槭属植物单倍型的分布模式及现今分布状况,我们推测,当第四纪冰川来临时,金钱槭属植物向南迁移并定居于不同的避难所中。其中云南金钱槭避难于云南省东南部山区,金钱槭避难于秦岭南坡、大巴山东段、岷山山脉及武陵山东部的局部地区。当冰期结束气候缓和时,避难于秦岭南坡的金钱槭个体分别向东北、西北方向回迁,避难于大巴山东段的金钱槭则向西北方向迁移,形成现今的分布格局。
基于本文的研究结果,我们对金钱槭属植物的保护工作提出了以下几点建议:1)重视金钱槭、云南金钱槭周围生境的保护。例如,通过人工控制群落郁闭度,促进金钱槭、云南金钱槭的自然更新:2)禁止砍伐母树及毁坏幼苗;3)把金钱槭的4个地理单元作为4个管理单位分别进行保护,对每个云南金钱槭居群、甚至每个云南金钱槭个体都应加以保护;4)金钱槭、云南金钱槭的迁地保护居群不具有最高的遗传多样性,在进一步迁地保护中应从所有居群中选取足够的样本,通过加大居群间种子和幼苗的交换,人为创造基因交流和重组的条件,以保存其遗传多样性。
在后续研究中应着重解决以下几方面的问题。首先,利用AFLP分子标记技术,进一步阐明金钱槭属植物的种内遗传多样性水平。同时结合本文得到的RAPD结果分析两种标记在研究金钱槭属植物遗传多样性及遗传结构中的一致性。其次,加大对贵州、四川两省的采样密度,通过进行进一步的分子亲缘地理学分析,更加精确、科学地揭示金钱槭属植物的冰期避难所及其冰期后迁居路线。第三,选取能显示金钱槭、云南金钱槭特有位点的引物/酶组合对两物种进行PCR-RFLP分析,并对各自特有位点的DNA序列进行测定,为探讨两物种的亲缘关系、分类学地位提供DNA水平上的直接证据。
首先,通过查阅标本、翻阅资料、走访有关专家及对云南、湖北、重庆等9个省市33个代表性地点的野外实地调查,较为全面、系统地报道了金钱槭属植物的生长状况、生存环境、人为干扰等情况,为对该属植物进行全面研究补充了基本资料。
其次,应用RAPD标记技术对金钱槭、云南金钱槭居群的遗传多样性和遗传分化进行了比较研究。利用18条随机引物对17个金钱槭居群的226个个体进行扩增,共检测到128个位点,其中多态位点119个。总多态位点比率(PPB)为92.97%,显示金钱槭具有较高水平的遗传多样性。Shannon多样性指数(0.5563)、Nei基因多样性指数(0.3864)和基因分化系数值(GSt=0.4470)说明,尽管大多数遗传变异仍然存在于居群内,但居群间已产生较高水平的遗传分化。AMOVA分析结果显示,金钱槭居群内遗传变异占总遗传变异量的56.89%,居群间遗传变异占总变异量的43.11%,进一步支持了上述结果。金钱槭居群间的基因流Nm=0.6685,Nm<1.居群间基因交流匮乏。居群间地理距离与遗传距离(经、纬度,海拔)的相关性分析结果显示,遗传距离与经度差异间具有极显著水平的正相关性(P<0.01),聚类分析、主成分分析结果也显示出各聚类群与地理差异存在相关性的趋势。用相同的18条引物对4个云南金钱槭居群的45个个体进行RAPD扩增,共检测到103个位点,其中多态位点84个,云南金钱槭物种水平的多态位点比率为81.55%。AMOVA分析结果揭示,云南金钱槭居群内遗传变异占总变异量的57.86%,居群间遗传变异占总变异量的42.14%,与基因分化系数(GST=0.4267)分析结果基本一致。云南金钱槭居群间的基因流Nm=0,6719,Nm<1,居群间基因交流十分有限。居群间遗传距离与地理隔离的相关性分析结果显示,云南金钱槭居群间遗传距离与地理隔离不存在显著的相关性。对金钱槭、云南金钱槭居群遗传多样性及遗传分化进行比较发现:1)金钱槭的遗传多样性水平高于云南金钱槭,符合广布种的遗传多样性高于狭域种这一规律。2)金钱槭、云南金钱槭居群间的遗传分化均已达到较高水平,居群间的基因流匮乏。3)在大尺度上(金钱槭)遗传距离与地理距离有相关性而在小范围内(云南金钱槭)则无上述关系,这可能与位于不同分布区内的物种所承受的生境选择压力不同有关。
第三,通过测量27项果实、种子、枝叶的宏观、微观形态学性状,揭示了云南金钱槭的形态变异模式。同时结合遗传变异及生态因子资料,分析了云南金钱槭形态变异的产生、维持机制。形态学性状分析结果表明:1)各居群形态性状变异系数平均值从大到小的排列顺序为:文山居群>屏边居群>黑龙潭居群>蒙自居群。2)在27个性状中,有4个性状在居群间的差异达显著性水平(P<0.05),15个达极显著水平(P<0.01)。果实长度在居群间的变异最大,小叶叶长/叶柄长在居群间的变异最小。3)文山居群与屏边、黑龙潭、蒙自居群间已产生显著或极显著水平的形态差异,而后三者间的差异未达显著水平。形态变异与遗传变异、生态因子间的相关分析结果显示:1)形态性状变异系数与多态位点比率、Shannon多样性指数及Nei基因多样性指数间存在着正相关关系,但相关性均未达显著水平。2)形态变异与生态因子间存在较复杂的相关性,海拔、土壤含水量等6个生念因子与一些形态性状的相关性已达显著或极显著水平。相对于其它生态因子来说,海拔对形念性状变异的影响最大。上述结果说明,云南会钱槭的形态变异虽然具有一定的遗传基础,但可塑性及环境压力对形态变异所产生的作用更大一些。基于形态性状和RAPD数据的聚类分析结果进一步说明,云南金钱槭的形态变异受到环境因子的强烈影响而与遗传背景的关系不显著。
第四,本文采用PCR-RFLP技术对金钱槭属植物进行了分子亲缘地理学研究。选取7对叶绿体DNA通用引物对来自17个金钱槭居群、4个云南金钱槭居群的63个个体进行PCR扩增,扩增产物用HaeⅢ、FunDⅡ等四种4碱基内切酶和EcoRⅠ+RsaⅠ、HindⅢ+Hin6Ⅰ两种4、6碱基限制性内切酶组合进行酶切。42种引物/酶组合在云南金钱槭中共检测到109个DNA片段,所有片段均为单态,在金钱槭中共检测到124个片段,其中多态片段20个,多态片段占总片段数量的16.13%。分析所有酶切片段,发现了6种cpDNA单倍型,其中云南金钱槭独享一种单倍型,金钱槭具有另外5种单倍型。金钱槭的5种单倍型具有明显的地理分化,根据单倍型的地理分布格局和所属山系,将所研究的金钱槭居群划分为4个地理单元:秦岭地理单元、武陵山地理单元、岷山地理单元和大巴山地理单元。通过AMOVA软件计算得到4个地理分布单元间的分化系数(GST)值为0.9299,即有92.99%的遗传变异存在于地理分布单元间,7.01%的遗传变异存在于地理单元内,说明金钱槭cpDNA变异主要发生在地理单元间,而地理单元内的遗传变异较少。基于GST值,计算地理分布单元间cpDNA基因流仅为0.0377,地理单元间的遗传分化水平十分显著。在众多影响种内遗传变异分布格局的因素中,第四纪冰川可能是一个重要的影响因子,冰川来临时动植物物种有一系列向赤道方向迁移、压缩并在避难所中躲避恶劣气候的现象,随着冰川的消退和温度的回升,幸存生物的分布范围开始重新扩展。我国的第四纪冰川属于山岳冰川,冰川活动被限制在局部地区,形成了较多的冰期避难所。根据第四纪环境、植被变化特点,结合金钱槭属植物单倍型的分布模式及现今分布状况,我们推测,当第四纪冰川来临时,金钱槭属植物向南迁移并定居于不同的避难所中。其中云南金钱槭避难于云南省东南部山区,金钱槭避难于秦岭南坡、大巴山东段、岷山山脉及武陵山东部的局部地区。当冰期结束气候缓和时,避难于秦岭南坡的金钱槭个体分别向东北、西北方向回迁,避难于大巴山东段的金钱槭则向西北方向迁移,形成现今的分布格局。
基于本文的研究结果,我们对金钱槭属植物的保护工作提出了以下几点建议:1)重视金钱槭、云南金钱槭周围生境的保护。例如,通过人工控制群落郁闭度,促进金钱槭、云南金钱槭的自然更新:2)禁止砍伐母树及毁坏幼苗;3)把金钱槭的4个地理单元作为4个管理单位分别进行保护,对每个云南金钱槭居群、甚至每个云南金钱槭个体都应加以保护;4)金钱槭、云南金钱槭的迁地保护居群不具有最高的遗传多样性,在进一步迁地保护中应从所有居群中选取足够的样本,通过加大居群间种子和幼苗的交换,人为创造基因交流和重组的条件,以保存其遗传多样性。
在后续研究中应着重解决以下几方面的问题。首先,利用AFLP分子标记技术,进一步阐明金钱槭属植物的种内遗传多样性水平。同时结合本文得到的RAPD结果分析两种标记在研究金钱槭属植物遗传多样性及遗传结构中的一致性。其次,加大对贵州、四川两省的采样密度,通过进行进一步的分子亲缘地理学分析,更加精确、科学地揭示金钱槭属植物的冰期避难所及其冰期后迁居路线。第三,选取能显示金钱槭、云南金钱槭特有位点的引物/酶组合对两物种进行PCR-RFLP分析,并对各自特有位点的DNA序列进行测定,为探讨两物种的亲缘关系、分类学地位提供DNA水平上的直接证据。