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目的:大量研究显示随着年龄的增加,心肌细胞衰老引起的相关疾病如充血性心力衰竭、冠心病等发病率也随之增加,严重威胁人类健康。因此,延缓心肌细胞衰老越来越受到关注。基于此,本研究拟从衰老大鼠和衰老心肌细胞为基础,从整体水平和细胞水平探讨三七总皂苷(Total saponins of Panax notoginseng,TPNS)能否通过调节SIRT1和PGC-1α进而调控线粒体结构和功能,减少氧化应激损伤,发挥对衰老心肌细胞的保护作用。 方法:第一部分:将SPF级雄性SD大鼠随机分为七组:3月龄组(3M组)、9月龄组(9M组)、15月龄组(15M组),24月龄衰老组(24M组),三七总皂苷低剂量组(TPNS10 mg/kg)、三七总皂苷中剂量组(TPNS30 mg/kg)、三七总皂苷高剂量组(TPNS60 mg/kg),各组均10只大鼠。大鼠18月龄开始,通过灌胃的方式,给予不同剂量三七总皂苷至24个月,每天一次,每周停药两天,连续6个月后进行实验。采用HE染色观察大鼠心肌组织形态,采用酶生化法检测心肌组织中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、钠钾ATP酶( Na+-K+-ATP)活力、钙 ATP酶( Ca2+-ATP)活力、钙镁 ATP酶(Ca2+-Mg2+-ATP)活力。采用Western blot检测相关的蛋白:P21,沉默信息调剂因子2同源蛋白(Silentmating type information regulation2 homolog-1,SIRT1)、过氧化物酶体激活物受体γ辅激活因子1α(peroxisomal proliferator-activated receptor-coactivator1α,PGC-1α) 第二部分:将细胞随机分为五组:正常对照组,D-半乳糖衰老组,三七总皂苷5μg/mL(TPNS5μg/mL),三七总皂苷25μg/mL(TPNS25μg/mL),三七总皂苷50μg/mL(TPNS50μg/mL)。取对数生长期的H9c2细胞接种于孔板中,培养24小时后加入三七总皂苷5μg/mL,三七总皂苷25μg/mL,三七总皂苷50μg/mL培养4小时,4小时后各剂量组中分别加入50 mmol/L的D-半乳糖继续培养24小时。正常组中的细胞每隔12小时换液一次,共培养24小时,D-半乳糖衰老组中的细胞加入50mmol/L的D-半乳糖作用24小时。采用β-半乳糖苷酶检测H9c2心肌细胞衰老程度;DCFA-DA探针法检测H9c2心肌细胞内ROS的含量;采用Hoechst33342试剂盒检测H9c2心肌细胞凋亡的程度;采用酶生化法检测H9c2心肌细胞中SOD的活性、MDA的含量;采用线粒体膜电位试剂盒检测H9c2心肌细胞中线粒体膜电位的变化;加入SIRT1阻断剂后,采用相同的方法观察细胞中ROS含量以及线粒体膜电位的变化;采用Western blot检测相关的蛋白:SIRT1、PGC-1α检测 结果:第一部分:(1)衰老大鼠模型成功建立:与3月龄大鼠心脏组织相比较,通过HE染色法观察到24月龄大鼠心肌细胞体积显著增加,心肌纤维分布疏松、紊乱,心肌细胞核深染现象明显增多。通过酶生化法观察到24月龄大鼠心脏组织中MDA的含量显著增加(P<0.01),以此同SOD的活性、Na+K+-ATP酶活性、Ca2+-ATP酶活性以及Ca2+Mg2+-ATP酶活性显著降低(P<0.01);通过 Western blot观察到24月龄大鼠心脏组织中P21蛋白表达水平显著增加,SIRT1蛋白表达水平以及PGC-1α蛋白表达水平显著降低(P<0.01);(2)与24月龄衰老大鼠相比较,通过HE染色法观察到三七总皂苷可以改善衰老大鼠心肌细胞的形态,使衰老大鼠心肌细胞体积显著减少,纤维走形整齐致密,心肌细胞间质含量显著减少;通过酶生化法观察到三七总皂苷降低MDA的含量(P<0.05或P<0.01),以此同时三七总皂苷提高SOD的活性,Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-ATP酶活性及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P<0.05或P<0.01),通过Western blot观察到三七总皂苷下调P21蛋白表达水平,以此同时三七总皂苷上调SIRT1蛋白和PGC-1α蛋白表达水平表达(P<0.05或P<0.01) 第二部分:(1)H9c2心肌细胞衰老模型成功建立:与正常组相比,D-半乳糖衰老组细胞形态肥大,细胞中出现大量的空泡;通过β-半乳糖苷酶染色发现大H9c2细胞染成蓝色;同时,通过DCFA-DA探针法检测发现D-半乳糖组中ROS含量显著增强;大量细胞出现核固缩,线粒体膜电位检测发现线粒体膜电位水平显著降低;通过酶生化法观察到D-半乳糖组中SOD活性显著降低(P<0.01)以及MDA含量显著增加(P<0.01)。Western blot结果表明D-半乳糖组中SIRT1蛋白和PGC-1α蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。(2)与D-半乳糖衰老组比较,三七总皂苷可改善衰老H9c2心肌细胞形态,使得衰老心肌细胞体积显著变小与此同时衰老H9c2心肌细胞内空泡显著减少,通过β-半乳糖苷酶染色观察发现染成蓝色的细胞减少;通过DCFA-DA探针法检测三七总皂苷降低衰老H9c2心肌细胞内ROS的荧光强度,通过线粒体膜电位检测法发现三七总皂苷提高衰老心肌细胞线粒体膜电位水平,通过 Hoechst33342试剂盒检测发现三七总皂苷改善衰老H9c2心肌细胞凋亡程度;酶生化法实验表明三七总皂苷增强衰老H9c2心肌细胞中SOD的活力,降低MDA的含量(P<0.01);Western blot法表明三七总皂苷上调SIRT1蛋白表达水平和 PGC-1α蛋白表达水平;研究发现:加入SIRT1阻断剂后,三七总皂苷减少衰老细胞中ROS水平以及增加线粒体膜电位水平可部分被SIRT1阻断剂所拮抗,进一步说明三七总皂苷可能通过调节 SIRT1信号通路发挥延缓衰老心肌细胞的保护作用。 结论:三七总皂苷对心肌细胞衰老具有保护作用,这可能是通过调控SIRT1和PGC-1α通路进而改善心肌细胞中线粒体的结构与功能,从而延缓心脏衰老。