研究背景:随着人们生活水平的提高,糖尿病患病率呈现逐年增长的趋势。糖尿病患者主要死于心血管疾病,其中又以缺血性心脏病(IHD)为主。更为严重的是,糖尿病患者发生缺血性心脏病后心肌损伤程度明显加重,呈现缺血易损状态。研究显示,糖尿病心肌中Fox O1的活化可通过激活硝基应激和内质网应激加重糖尿病心肌缺血/再灌注损伤,但具体上游信号机制尚不清楚,可能与内源性保护机制的减弱有关。该问题的研究将为临床指导糖尿病缺血性心脏病的诊治提供一定的实验基础。Quaking5(QKI5)是STAR家族(Signal Transduction and Activators of RNAs)成员之一,可通过与m RNA 3’UTR区结合调控m RNA的转录后功能。本课题组前期研究发现,QKI5在心肌缺血/再灌注处理中通过抑制Fox O1的表达减少心肌损伤。这提示,QKI5具有抗心肌/.缺血再灌注损伤的保护作用。但是,QKI5在糖尿病心肌中的作用,及其是否参与糖尿病心肌缺血易损性的增加尚未见任何报道。实验目的:探讨QKI5与糖尿病心肌缺血易损性增加的机制,初步阐明QKI5在糖尿病心肌缺血/再灌注(I/R)中保护作用及意义。实验方法:本研究采用雄性ob/ob小鼠及正常C57BL/6小鼠分别随机分为假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(I/R,30min/4h),比较两组小鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌梗死面积、凋亡、QKI5及Fox O1表达、硝化应激和内质网应激水平。通过检测血清LDH水平,i NOS,e NOS表达及磷酸化水平,Caspase3活性,以及总NO和硝基酪氨酸生成量评估硝化应激水平。通过检测PERK、e IF-2α、CHOP、IRE1a及GRP78的表达及磷酸化水平评估内质网应激水平。测定心肌内注射敲除Fox O1及导入QKI5重组腺病毒载体后MI/R前后糖尿病小鼠心肌上述指标的变化情况。实验结果:1.与C57BL/6小鼠相比,ob/ob小鼠具有糖尿病小鼠模型的特征,表现为:体重、心重、脂肪含量、胫骨长短以及心重/胫骨长短明显增加、糖耐量显著下降。此外,ob/ob小鼠(12周)心肌呈现I/R损伤加重,其心肌梗死面积及乳酸脱氢酶(LDH)水平均增加。2.ob/ob小鼠心肌中Fox O1表达明显升高,处于激活状态。通过比较C57BL/6小鼠及ob/ob小鼠心肌细胞核Fox O1、细胞浆Fox O1及总的Fox O1水平,可见ob/ob小鼠心肌中有活性的Fox O1水平明显增高,提示ob/ob小鼠心肌中Fox O1的激活可能与糖尿病心肌I/R损伤加重有关。3.为进一步研究糖尿病心肌缺血/再灌注损伤敏感性增加的机制,实验对WT及ob/ob小鼠非缺血/再灌注处理条件下的硝基应激水平进行测定。结果发现,ob/ob小鼠心肌细胞中总NO含量及硝基酪氨酸生成量增加,i NOS表达显著上调,e NOS磷酸化水平下降,而其表达无明显变化。上述结果表明,糖尿病心肌中硝化应激水平增强。更为重要的是,给予ob/ob小鼠心肌I/R处理后,心肌损伤程度明显加重,若于再灌注前给予硝基应激抑制剂,可见心肌I/R损伤程度有所减轻,但并非完全恢复。以上结果表明,糖尿病心肌中活化的硝化应激是糖尿病缺血易损性增加的重要因素,但还可能存在其他潜在加重糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的机制。4.实验对比WT及ob/ob小鼠心肌细胞中内质网应激水平,结果显示,ob/ob小鼠心肌细胞中内质网应激处于激活状态,即p-PERK、p-e IF2α、CHOP水平显著增高。通过检测ob/ob小鼠心肌I/R后凋亡水平,发现ob/ob+I/R组小鼠心肌Caspase-12及Caspase-3水平明显增加,且增高的Caspase-12可以被内质网应激抑制剂SAL抑制,但增加的Caspase-3只能部分被SAL抑制。这提示,糖尿病状态下激活的内质网应激参与糖尿病心肌缺血易损性的增加有关,但活化的内质网应激部分参与糖尿病心肌I/R损伤。为了进一步观察糖尿病状态下活化的内质网应激与活化的硝基应激通路是否相互影响,实验给予腹腔注射硝基应激抑制剂1400W/M40401并检测内质网应激指标以及给予腹腔注射内质网应激抑制剂SAL并检测硝基酪氨酸含量。以上实验结果提示糖尿病状态下,心肌缺血易损性增加,且硝化应激及内质网应激是增加心肌缺血易损性的独立因素。5.为了进一步验证糖尿病心肌中活化的内质网应激和硝基应激及其引起的I/R损伤加重与糖尿病心肌中过度激活的Fox O1间的关系,实验采用心肌病毒点注射Fox O1 si RNA的方法下调ob/ob小鼠心肌Fox O1的表达。结果发现,糖尿病心肌中硝基应激及内质网应激水平被明显抑制、心肌I/R损伤也减轻。这提示,糖尿病心肌中Fox O1的活化与硝基应激及内质网应激的激活有关,并参与糖尿病心肌缺血易损性的发生。6.为阐明糖尿病心肌中Fox O1激活与QKI5表达改变的关系,实验首先检测糖尿病心肌中QKI5的表达情况,结果显示,ob/ob小鼠心肌中QKI5表达明显降低。在此基础上,采用心肌病毒点注射Ad-QKI5的方法使ob/ob小鼠心肌过表达的QKI5并检测其Fox O1、硝化应激及内质网应激的水平变化。结果表明,过表达QKI5可以抑制ob/ob小鼠心肌Fox O1的活化及其下游硝基应激和内质网应激的过度激活。为了进一步研究糖尿病心肌中过表达的QKI5是否可通过抑制Fox O1起到保护心脏的作用,实验对比了ob/ob+I/R+Ad-QKI5小鼠组及ob/ob+I/R+vehicle小鼠组Fox O1表达水平、心脏功能、心肌凋亡水平以及心肌梗死面积。结果表明,过表达QKI5可降低改善ob/ob小鼠Fox O1表达,改善心脏功能、减少心肌损伤和死亡。7.为进一步阐明QKI5对Fox O1表达的抑制机制。实验采用RNA-IP技术检测发现,QKI5可以结合于Fox O1 m RNA。进而在心肌细胞过表达QKI5后给予转录抑制剂(actinomycin D)并观察Fox O1m RNA的代谢情况。结果显示,过表达QKI5组心肌细胞内的Fox O1m RNA的半衰期明显缩短。这提示,QKI5是通过与Fox O1m RNA结合使其稳定性降低加速其降解,进而抑制Fox O1蛋白的表达。结论1.糖尿病心肌中QKI5的减少导致Fox O1过度激活,从而引起糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的加重。2.糖尿病心肌可通过过表达QKI5实现对Fox O1的抑制,这种抑制作用是通过促进Fox O1 m RNA降解实现的。3.糖尿病心肌Fox O1的激活参与糖尿病心肌缺血易损性的增加主要是通过激活其下游的硝基应激和内质网应激实现的。