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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染所致的以母猪流产、死胎或木乃伊胎，同时导致育肥猪和仔猪呼吸障碍的高度传染病。目前，PRRS仍在全球大部分地区流行，尤其是自2006年以来，高致病性PRRS（HP-PRRS）的暴发给养猪业造成巨大的经济损失。虽然全球针对PRRS的防控研究已持续进行了30多年，仍然没有安全有效的疫苗及治疗药物得以认证并推广使用。由于PRRSV的高度变异致使有效疫苗的研发存在较大障碍，因此，有必要尝试开发新型抗病毒策略。 前期研究证明PRRSV感染猪后会产生特异性针对GP5和M蛋白的自身抗独特型抗体（Auto-anti-idiotypic antibodies，Aab-2s），其中一部分Aab-2s可与抗GP5抗体分子的抗原结合部位决定簇反应，从而阻断其与抗原结合，即为GP5的“内影像”。这类抗体一方面可作为抗独特型抗体疫苗，同时可以作为筛选和鉴定病毒入侵所需受体的工具。本实验室前期利用所制备的针对PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2）从PRRSV易感细胞PAM和MARC-145中发现了介导病毒进入靶细胞的重要蛋白，非肌肉肌球蛋白II-A（MYH9），由于Mab2-5G2具有模拟PRRSV囊膜糖蛋白GP5的功能，提示MYH9可能是病毒GP5蛋白结合易感细胞的一个功能性受体蛋白因子，基于前期研究基础，本研究主要目标如下： 1.Mab2-5G2与MYH9分子互作的关键区域的确定 非肌肉肌球蛋白II（Non-muscle myosin II，NM II）在正常细胞中发挥的生物功能主要包括：细胞迁移、有丝分裂、囊泡转移修复、胞质分裂和细胞因子分泌等。哺乳动物的NM II包含3个亚型，根据其重链命名为NM II-A(MYH9)，NM II-B(MYH10)，NM II-C(MYH14)，三者的氨基酸同源性高达64%~80%，序列比对分析发现其氨基酸差异主要位于氨基端和羧基端。为了查找Mab2-5G2与MYH9结合的区域，我们首先设计间并引物扩增猪源MYH9全长序列，然后将MYH9基因分成四部分进行扩增，分别克隆到真核表达质粒pCAGEN-HA，瞬时转染真核HEK-293T细胞48h，收取细胞并借助蛋白免疫印迹试验，初步确定Mab2-5G2的结合区域位于MYH9的羧基端aa1651-1960，将该区域命名为PRA。 2.MYH9蛋白羧基端的关键区域PRA可溶表达和阻断PRRSV感染研究 为了探究重组表达的PRA蛋白能否作为一种潜在的受体阻断剂抑制PRRSV感染，我们利用原核表达系统获得可溶的PRA蛋白，通过ELISA和Western blot试验分别证实抗独特型抗体Mab2-5G2结合PRA蛋白。本研究进一步将PRRSV SD16、VR-2332毒株分别与PRA蛋白或PCV2Cap对照蛋白混合后感染易感细胞，结果显示如下： （1）PRA蛋白在PRRSV易感细胞MARC-145和PAM以及易感细胞系PK-15CD163和CRL-2843CD163上显著阻断PRRSV-2型SD16及VR-2332感染，其阻断效果均呈剂量依赖性。 （2）PRA蛋白在PAM和MARC-145细胞中对PRRSV-1型（GZ11-G1和P073-3）和PRRSV-2型（JXA1、VR-2385、CH-1a、GD-HD）的增殖均具有抑制作用。 （3）PRA蛋白通过结合PRRSV GP5蛋白来捕获病毒。 （4）PRA与PRRSV结合后导致细胞胞浆中MYH9向细胞膜上迁移减少，从而降低PRRSV内化。 3.MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的确定 PRRSV进入宿主细胞主要依靠相关受体介导，其中CD163和MYH9是作为介导PRRSV吸附内化入胞过程中所必需的两个因子。为了探究不同种属MYH9是否均可作为PRRSV感染的重要介导因子并确定MYH9介导病毒入侵的关键区域，首先，分别构建稳定表达猪源CD163的PK-15（PK-15CD163），HEK-293T（HEK-293TCD163）和BHK-21（BHK-21CD163）的PRRSV易感细胞系，用Blebbistatin（MYH9特异性抑制剂）或siRNA(针对不同种源MYH9)处理这些细胞系，感染病毒48h。间接免疫荧光，qPCR和Western blot试验结果显示：PRRSV感染水平伴随着MYH9活性或表达下降而降低；然后，用大肠杆菌系统分别表达不同种属的PRA蛋白，证实其对PRRSV感染的均具有阻断作用。比较不同种属PRA氨基酸序列的差异，最后，以猪源PRA为例，对该区域进行逐步截短表达，通过病毒阻断试验筛选获得关键区域为aa1676-1791，同时制备针对该区域的多克隆抗体显著抑制PRRSV感染PAM和MARC-145细胞。由此推断该区域可能是MYH9介导PRRSV入侵的关键区域。 4.Mab2-5G2与MYH9结合位点鉴定与功能研究 为了探究Mab2-5G2是否可以作为“竞争阻断剂”结合细胞表面MYH9从而影响PRRSV GP5结合MYH9，进而降低病毒的感染。本研究在PAM细胞上初步证实Mab2-5G2具有抵抗PRRSV感染的作用。同时Mab2-5G2对PRRSV SD16，JXA1，CH-1a，VR-2332，VR-2385和GD-HD等不同毒株均具有阻断效果。为查找Mab2-5G2与MYH9的结合位点，首先构建PRA截短体，以及合成多肽，借助ELISA和Western blot技术逐步缩小与Mab2-5G2结合的范围；通过抗体测序获得Mab2-5G2Fab序列，分别借助同源建模方法获得Mab2-5G2Fab与MYH9结合的空间结构。通过Chimera软件对两者进行分子对接（Docking），初步确定Mab2-5G2结合MYH9的位点位于MYH9的羧基端E1670，K1673，E1679和I1683；通过构建重组表达PRA突变体（PRA1670，PRA1673，PRA1679，PRA1683和PRA1670,1673,1679,1683）进行Mab2-5G2结合活性和病毒阻断的功能验证。结果显示，PRA突变体蛋白与Mab2-5G2及与病毒粒子结合活性以及阻断PRRSV的内化能力明显下降。由此推断，E1670，K1673，E1679和I1683可能是PRRSV囊膜蛋白GP5结合MYH9入侵易感细胞的结合位点。 本研究鉴定出Mab2-5G2的结合区域位于MYH9的羧基端PRA（aa1651-1960），重组表达PRA具有良好的抗PRRSV活性，PRA可通过与细胞內源性MYH9竞争结合病毒的GP5蛋白，降低病毒的内化，抑制PRRSV感染。同时证实不同种属MYH9均参与病毒复制，借助阻断试验确定结合PRRSV的关键区域位于aa1676-1791。进一步研究发现Mab2-5G2对PRRSV感染具有明显地阻断作用，通过同源建模和分子对接预测Mab2-5G2与PRA结合位点为E1670，K1673，E1679和I1683，并进行了相关的功能验证，本研究进一步揭示PRRSV进入机制和开发新型抗病毒制剂提供理论依据。