猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究

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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染所致的以母猪流产、死胎或木乃伊胎,同时导致育肥猪和仔猪呼吸障碍的高度传染病。目前,PRRS仍在全球大部分地区流行,尤其是自2006年以来,高致病性PRRS(HP-PRRS)的暴发给养猪业造成巨大的经济损失。虽然全球针对PRRS的防控研究已持续进行了30多年,仍然没有安全有效的疫苗及治疗药物得以认证并推广使用。由于PRRSV的高度变异致使有效疫苗的研发存在较大障碍,因此,有必要尝试开发新型抗病毒策略。  前期研究证明PRRSV感染猪后会产生特异性针对GP5和M蛋白的自身抗独特型抗体(Auto-anti-idiotypic antibodies,Aab-2s),其中一部分Aab-2s可与抗GP5抗体分子的抗原结合部位决定簇反应,从而阻断其与抗原结合,即为GP5的“内影像”。这类抗体一方面可作为抗独特型抗体疫苗,同时可以作为筛选和鉴定病毒入侵所需受体的工具。本实验室前期利用所制备的针对PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)从PRRSV易感细胞PAM和MARC-145中发现了介导病毒进入靶细胞的重要蛋白,非肌肉肌球蛋白II-A(MYH9),由于Mab2-5G2具有模拟PRRSV囊膜糖蛋白GP5的功能,提示MYH9可能是病毒GP5蛋白结合易感细胞的一个功能性受体蛋白因子,基于前期研究基础,本研究主要目标如下:  1.Mab2-5G2与MYH9分子互作的关键区域的确定  非肌肉肌球蛋白II(Non-muscle myosin II,NM II)在正常细胞中发挥的生物功能主要包括:细胞迁移、有丝分裂、囊泡转移修复、胞质分裂和细胞因子分泌等。哺乳动物的NM II包含3个亚型,根据其重链命名为NM II-A(MYH9),NM II-B(MYH10),NM II-C(MYH14),三者的氨基酸同源性高达64%~80%,序列比对分析发现其氨基酸差异主要位于氨基端和羧基端。为了查找Mab2-5G2与MYH9结合的区域,我们首先设计间并引物扩增猪源MYH9全长序列,然后将MYH9基因分成四部分进行扩增,分别克隆到真核表达质粒pCAGEN-HA,瞬时转染真核HEK-293T细胞48h,收取细胞并借助蛋白免疫印迹试验,初步确定Mab2-5G2的结合区域位于MYH9的羧基端aa1651-1960,将该区域命名为PRA。  2.MYH9蛋白羧基端的关键区域PRA可溶表达和阻断PRRSV感染研究  为了探究重组表达的PRA蛋白能否作为一种潜在的受体阻断剂抑制PRRSV感染,我们利用原核表达系统获得可溶的PRA蛋白,通过ELISA和Western blot试验分别证实抗独特型抗体Mab2-5G2结合PRA蛋白。本研究进一步将PRRSV SD16、VR-2332毒株分别与PRA蛋白或PCV2Cap对照蛋白混合后感染易感细胞,结果显示如下:  (1)PRA蛋白在PRRSV易感细胞MARC-145和PAM以及易感细胞系PK-15CD163和CRL-2843CD163上显著阻断PRRSV-2型SD16及VR-2332感染,其阻断效果均呈剂量依赖性。  (2)PRA蛋白在PAM和MARC-145细胞中对PRRSV-1型(GZ11-G1和P073-3)和PRRSV-2型(JXA1、VR-2385、CH-1a、GD-HD)的增殖均具有抑制作用。  (3)PRA蛋白通过结合PRRSV GP5蛋白来捕获病毒。  (4)PRA与PRRSV结合后导致细胞胞浆中MYH9向细胞膜上迁移减少,从而降低PRRSV内化。  3.MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的确定  PRRSV进入宿主细胞主要依靠相关受体介导,其中CD163和MYH9是作为介导PRRSV吸附内化入胞过程中所必需的两个因子。为了探究不同种属MYH9是否均可作为PRRSV感染的重要介导因子并确定MYH9介导病毒入侵的关键区域,首先,分别构建稳定表达猪源CD163的PK-15(PK-15CD163),HEK-293T(HEK-293TCD163)和BHK-21(BHK-21CD163)的PRRSV易感细胞系,用Blebbistatin(MYH9特异性抑制剂)或siRNA(针对不同种源MYH9)处理这些细胞系,感染病毒48h。间接免疫荧光,qPCR和Western blot试验结果显示:PRRSV感染水平伴随着MYH9活性或表达下降而降低;然后,用大肠杆菌系统分别表达不同种属的PRA蛋白,证实其对PRRSV感染的均具有阻断作用。比较不同种属PRA氨基酸序列的差异,最后,以猪源PRA为例,对该区域进行逐步截短表达,通过病毒阻断试验筛选获得关键区域为aa1676-1791,同时制备针对该区域的多克隆抗体显著抑制PRRSV感染PAM和MARC-145细胞。由此推断该区域可能是MYH9介导PRRSV入侵的关键区域。  4.Mab2-5G2与MYH9结合位点鉴定与功能研究  为了探究Mab2-5G2是否可以作为“竞争阻断剂”结合细胞表面MYH9从而影响PRRSV GP5结合MYH9,进而降低病毒的感染。本研究在PAM细胞上初步证实Mab2-5G2具有抵抗PRRSV感染的作用。同时Mab2-5G2对PRRSV SD16,JXA1,CH-1a,VR-2332,VR-2385和GD-HD等不同毒株均具有阻断效果。为查找Mab2-5G2与MYH9的结合位点,首先构建PRA截短体,以及合成多肽,借助ELISA和Western blot技术逐步缩小与Mab2-5G2结合的范围;通过抗体测序获得Mab2-5G2Fab序列,分别借助同源建模方法获得Mab2-5G2Fab与MYH9结合的空间结构。通过Chimera软件对两者进行分子对接(Docking),初步确定Mab2-5G2结合MYH9的位点位于MYH9的羧基端E1670,K1673,E1679和I1683;通过构建重组表达PRA突变体(PRA1670,PRA1673,PRA1679,PRA1683和PRA1670,1673,1679,1683)进行Mab2-5G2结合活性和病毒阻断的功能验证。结果显示,PRA突变体蛋白与Mab2-5G2及与病毒粒子结合活性以及阻断PRRSV的内化能力明显下降。由此推断,E1670,K1673,E1679和I1683可能是PRRSV囊膜蛋白GP5结合MYH9入侵易感细胞的结合位点。  本研究鉴定出Mab2-5G2的结合区域位于MYH9的羧基端PRA(aa1651-1960),重组表达PRA具有良好的抗PRRSV活性,PRA可通过与细胞內源性MYH9竞争结合病毒的GP5蛋白,降低病毒的内化,抑制PRRSV感染。同时证实不同种属MYH9均参与病毒复制,借助阻断试验确定结合PRRSV的关键区域位于aa1676-1791。进一步研究发现Mab2-5G2对PRRSV感染具有明显地阻断作用,通过同源建模和分子对接预测Mab2-5G2与PRA结合位点为E1670,K1673,E1679和I1683,并进行了相关的功能验证,本研究进一步揭示PRRSV进入机制和开发新型抗病毒制剂提供理论依据。
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