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研究背景和目的：化学药物治疗作为恶性肿瘤治疗方法中重要的一部分，与适于局限性肿瘤的外科学手术治疗和放射治疗有着本质的不同，是肿瘤综合治疗的重要手段之一，尽管采用多药联合、大剂量化疗等手段不断改善肿瘤化疗的疗效，受个人耐受情况及化疗药剂量依赖性毒性的影响，化疗药物的治疗效果仍受到限制，传统化疗药物的治疗效果似乎进入平台期。肿瘤靶向治疗药，能特异性的结合肿瘤细胞上特异性表达的分子结构，具有高选择性、低毒等传统化疗药所不具有的优点，众多肿瘤靶向治疗药物表现出显著的抗肿瘤效果，靶向药物是目前肿瘤化疗药物研究的热点之一。组织因子（tissue factor，TF）从其凝血功能研究开始发现其与肿瘤的发生发展有着密切的联系，不仅与肿瘤患者血液高凝状态相关从而引起肿瘤患者静脉血栓形成，其诱导的凝血级联反应及与之相关的信号途径等机制与促进肿瘤血管形成、肿瘤转移和肿瘤生长有关，近年来TF与肿瘤干细胞之间联系性的提出为肿瘤的难治、复发提供了新的线索。且在多种恶性肿瘤中检测到TF异常增高表达。Hu等[1,2]设计的抗体类似物，由编码点突变（K341A）hfVII和免疫球蛋白效应片段（IgG1Fc）构成的免疫结合物（Immnoconjugate, Icon）在应用于包括黑色素瘤、前列腺癌、和乳腺癌等动物模型上时表现出显著效果，使移植瘤消退，但是，动物实验表现出该结合物对小鼠的凝血功能有一定影响的研究下。本研究在分析fVII晶体结构发现fVII由轻链和重链组成，轻链中EGF和Gla区与TF紧密结合有关，而重链则与凝血反应有关。且利用编码fVII轻链与IgG1Fc的腺病毒载体在结直肠癌动物模型中表现出良好的抗血管治疗作用。本研究利用分子克隆技术，构建hfVII-LC+IgG1Fc的真核细胞表达载体，转入CHO-K1细胞中体外获得hfVII-LC+IgG1Fc免疫结合物，以期减少hfVII对凝血功能的影响及腺病毒载体对肝功能的损害。研究内容和方法：第一部分TF在肿瘤细胞中的表达采用免疫荧光方法检测HT-29及NB4细胞株上TF的表达情况。第二部分hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白的制备和纯化1、分别从健康人外周血单个核细胞和肝组织中提取总RNA。2、采用RT-PCR方法分别扩增hIgG1Fc及hfVII-LC基因片段。3、用BamH I、EcoR I分别双酶切hfVII-LC PCR扩增产物和pcDNA3.1（+）质粒，T4DNA连接酶作用下连接，然后转化DH5感受态细胞，筛选mp抗性克隆，用PCR、双酶切及测序方法鉴定阳性克隆pcDNA3.1（+）--hfVII-LC，用同样的方法及EcoR I、Xho I内切酶构建pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc最后酶切及测序方法鉴定阳性克隆。4、以脂质体法转染阳性质粒入中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO-K1细胞，G418加压筛选获得阳性单克隆细胞，用半定量RT-PCR鉴定转染是否成功。5、Excell302无血清扩大培养，培养液Ni-NTA亲和层析纯化和制备hfVII-LC+hIgG1Fc融合蛋白，纯化后蛋白，BCA法测蛋白浓度。考马斯亮蓝检测亲和层析纯度。6、ELISA法检测不浓度融合蛋白与TF的靶向作用。第三部分噬菌体肽库序贯筛选TF靶向肽1、分别以纯化TF蛋白和具有TF高特异性表达的结直肠癌细胞株HT-29为靶分子，用噬菌体七肽库进行序贯筛选。2、ELISA初步鉴定噬菌体克隆对HT-29亲和力。3、噬菌体克隆进行测序，利用竞争抑制ELISA比较各合成肽的TF结合力。结果：第一部分免疫荧光法检测HT-29及NB4细胞膜呈现强红色荧光表达，表明有TF异常高表达，阴性对照则基本不发出荧光信号。第二部分1、分别从肝组织及外周血单个核细胞提取总RNA，经紫外分光光度计测的OD260/280在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高，且RNA于琼脂糖电泳条带清晰，完整。2、分别以肝组织及外周血单个核细胞总RNA为模板RT-PCR方法可分别扩增出696bp和456bp大小的两段基因片段，测序结果符合目的基因序列。3、pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc真核表达载体的构建使用特异引物进行RT-PCR，从肝组织和淋巴细胞中扩增得到目的基因片段，将其插入pcDNA3.1（+）真核表达载体，构建成pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc重组载体。经BamH I、EcoR I和Xho I三酶切，可见约5.4kb、696bp和456bp大小的三条带，分别为酶切后的载体片段及两条目的片段。将pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc阳性重组子进行DNA测序，测序结果与Genebank中的hfVII-LC、hIgG1Fc序列完全吻合，且带有编码6×His标签蛋白序列。说明pcDNA3.1（+）--hfVII-LC+hIgG1Fc真核表达载体构建成功。4、RT-PCR检测hfVII-LC+hIgG1Fc mRNA的表达对CHO-K1-hfVII-LC+hIgG1Fc细胞的总RNA进行RT-PCR扩增，结果扩增出大小为456bp的hfVII-LC条带，大小为1152bp的hfVII-LC+hIgG1Fc条带以及GAPDH大小为327bp。在相同RT-PCR扩增条件及加样量下，同步转染空质粒CHO-K1细胞无特异目的条带。5、SDS-PAGE凝胶检测通过Ni-NTA树脂纯化后蛋白的纯度和分子量大小收集的无血清培养基经过Ni-NTA树脂纯化纯化后得到较纯的目的蛋白分子量大小为55-70KD之间。经western blot检测纯化后的蛋白带有His标签蛋白。6、ELISA检测hfVII-LC+hIgG1Fc蛋白与TF的亲和力：分别检测5个不同稀释度0,0.01,0.1,1和10g/mL hf-LC+hIgG1Fc与TF的结合能力，在450/630nm双波长下分别测定其OD值：（各平行对照孔取平均值）分别为0.091±0.0012、0.283±0.0014、0.385±0.03、0.464±0.0116和0.765±0.0012（P<0.05）。OD值越高说明合成的免疫结合物与TF的结合增加，其中加入免疫复合物孔的OD值都高于未加入孔，提示免疫结合物与TF有亲和力，且呈剂量依赖性。第三部分1、回收率由于淘选出与TF特异性亲和性增加随机七肽库回收率由2.25×10-4%增加到1.32×10-2%。2、随机挑选的30个阳性噬菌体克隆与HT-29细胞上TF结合活性由ELISA初步鉴定以OD值为阴性对照值（0.64）3倍以上即为阳性，其阳性率为76.7%。3、按噬菌体DNA测序结果重复率高的基因序列人工合成多肽A、B、C、D、E，与抗TF抗体行ELISA竞争抑制法，分别读取OD值换算成IC50分别为3.25nM、6.72M、3.24×103M、2.08×102M和45.77M，其中以多肽A肽亲和力表现最高，呈剂量依赖性。结论：1、TF在各种肿瘤上异常表达，HT-29及NB4细胞株上亦有表达。2、成功构建了hfVII-LC+hIgG1Fc融合蛋白的真核表达载体。3、并获得了hfVII-LC+hIgG1Fc融合蛋白的，为后续研究以TF位靶点的肿瘤免疫治疗奠定了基础。4、筛选出TF靶向肽对TF具有高度的亲和力。