目的:乳腺癌在我国女性恶性肿瘤发病率中位居第一名，而且女性恶性肿瘤死亡率排名第二位是乳腺癌，它除了复发率高的特点，其转移率和死亡率也相对较高。并且研究发现自20世纪70年代末开始乳腺癌的发病率逐年增加。我国并不是乳腺癌的高发国家，但近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出很多高发国家，平均约1～2个百分点[1]。乳腺癌通过外科手术的方式治愈效果显著，但是由于手术术式的相对固定性因此今年来对于乳腺癌治疗的研究主要集中于化疗对乳腺癌细胞的作用和新药的开发和耐受等方面。　　自噬是细胞内溶酶体降解蛋白质和细胞器的过程，可以认为是自己吃掉自己的过程。细胞将自身的成分吞噬将其能量及养分转化为自身的能量，使细胞对内外部环境带来的不良影响具有抵抗力。按蛋白底物进入溶酶体内的方式的不同，将自噬被分为3大类型:大自噬，小自噬及分子伴侣介导的自噬。自噬是细胞内由溶酶体介导的一种蛋白质和细胞器降解过程。在正常生理条件及营养状态良好的情况下，自噬处在一个基本水平，以保持胞质更新并清除损伤的细胞器及蛋白质;在细胞内外环境发生变化或者饥饿的情况下，细胞将产生级联变化，自噬将被上调，这些变化包括蛋白聚合物的形成，DNA的损伤，感染及应激刺激等。酵母细胞如遇营养缺乏的情况，可对生存非必要的蛋白质进行降解，进而生成新的供其存活的蛋白质，进行自噬上调。另有一些通过对高级生物细胞的研究，研究对象生成后营养供给中断，自噬就在供给不足的情况下被激活。由于正常状态、异常乃至病理状态的细胞内均有可能发生自噬，因此我们大胆推测人类疾病的产生和发展与自噬都有紧密的关系。在一些专业领域的报道中，恶性肿瘤的发生发展与自噬有密切的关系，神经退行性疾病、肌肉疾病也不例外。另外，在细胞内自噬除了与疾病相关亦是保护机制，能够避免细胞免受病毒或细菌的危害。可见机体调控的整个生命过程均有自噬参与，细胞的成长发育分裂，以及一些病理状体也与自噬有一定关系。自噬被认为同时具有抑瘤和促瘤作用。在肿瘤刚刚发生时，自噬可以限制肿瘤发生的促进因子，如减少炎症反应、减少组织损伤和基因组不稳定性，因此我们认为刺激自噬可抑制肿瘤发生。当肿瘤形成后，应激反应发生，自噬因增加肿瘤细胞在应激中的存活率，因此被认为有利于肿瘤的生长。因此提出，肿瘤治疗中应以抑制自噬的方法增强治疗效果。过度自噬可导致细胞死亡，尤其是凋亡缺陷细胞。现研究已经证实，自噬调节可在抗肿瘤免疫治疗中发挥作用。　　内质网主要作用是提供细胞内蛋白质翻译合成、蛋白折叠、蛋白修饰和钙离子附着的载体，它还是重要的细胞器以使细胞对内外部刺激产生应激反应。内质网感受刺激到后可发生内质网应激，内质网应激最终可能与自噬相互作用，共同控制细胞的状态，使细胞逃避杀伤并产生耐药性，或者导致细胞的死亡。　　FAD(Falcarindiol法卡林二醇)是一种从姜黄素中提取的天然的聚炔烃，它有各种好的生物学活性。最近的研究表明FAD在肿瘤细胞中有很强的抗增殖作用。在这个实验中，我们在细节方面阐明了FAD在乳腺肿瘤细胞中的功能及机制。　　方法:　　①FAD对乳腺癌细胞及正常乳腺细胞的作用:我们选择了三组乳腺癌细胞系MDA-MB-231、SKBR3和MDA-MB-468及正常乳腺细胞MCF-10A这四组细胞系。首先选择MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-10A采用不同浓度加药FAD(0，3，6，12，24 uM)，观察24小时后经过MTT检测，检测出细胞增殖率变化。再选择MDA-MB-231、SKBR3、MDA-MB-468及MCF-10A细胞采用不同浓度加药FAD(0，3 uM)，观察24小时后经过流式细胞检测，检测出细胞死亡率。　　②FAD对乳腺癌细胞的作用途径选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(0，3 uM)，并同时加入Z-VAD(100uM)及Nec-1(40uM)观察24小时后细胞死亡率的变化。　　③FAD诱导乳腺癌细胞死亡与自噬的关系:选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(6 uM)通过Western blot分别观察给药后0、2、4、8小时后LC3的表达。MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD后CQ(20uM)，观察24小时后细胞死亡率的变化。之后通过敲除ATG3继续观察FAD对乳腺癌细胞的作用。　　④FAD诱导乳腺癌细胞死亡与内质网应激的关系:选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(0，1，3，6uM)，24小时后通过Western blot观察GRP78的表达。选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(6 uM)，通过Western blot观察0，2，4，8，24小时的GRP78的表达。选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(0，3，6uM)，24小时后通过RT-PCR观察CHOP及XBP1的表达。选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(6 uM)，通过RT-PCR观察0，2，4，8小时的GRP78的表达。敲除及过表达GRP78，观察FAD对乳腺癌细胞的死亡率的影响。⑤FAD引起内质网应激促成凋亡与细胞内蛋白质累计的关系:选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD及CHX(蛋白合成抑制剂)，24小时后通过流式细胞仪观察细胞死亡率，RT-PCR观察CHOP及XBP1的表达。　　⑥FAD与5-氟尿嘧啶和BRZ是否具有协同作用:选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入25 uM5-FU或BRZ10 nM，24小时后通过流式细胞仪观察细胞死亡率。　　结果:　　①FAD引起乳腺癌细胞的死亡:MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-10A在加药后(0，3，6，12，24 uM)，其中乳腺癌细胞的增殖率随着加药量的增加而减弱，当超过6uM后增殖率减少不明显，其中的正常细胞对加药后增殖率没有明显变化。MDA-MB-231、SKBR3、MDA-MB-468及MCF-10A在加药后(0，3 uM)，乳腺癌细胞死亡率随着加药量的增加而增加，而正常乳腺细胞变化不大。　　②FAD诱导caspase依赖的乳腺癌细胞的死亡:MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(0，3 uM)后Z-VAD(100uM)可以抑制FAD的作用，Nec-1(40uM)对FAD作用不能被抑制，因此说明FAD诱导的乳腺癌细胞死亡是caspase依赖途径。　　③自噬促成FAD诱导的乳腺癌细胞死亡:MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD(6 uM)通过Western blot分别观察给药后0、2、4、8小时后LC3的表达，可见下LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ水平明显变化。表明FAD相关的自噬已经发生。CQ阻断自噬后FAD诱发的细胞死亡明显下降。通过敲除ATG3后，FAD诱导的细胞死亡明显逃逸。这部分实验证明自噬促成FAD诱导的细胞死亡。　　④FAD诱导了乳腺癌的内质网应激:首先MDA-MB-231乳腺癌细胞加入FAD后可以观察到FAD可以诱导GRP78的表达，呈现出时间及剂量依赖性。在6uMFAD及药物作用8-24小时后GRP78的表达明显增加。RT-PCR:最早在2小时时FAD诱导的CHOP表达和XBP-1剪接能够被检测到，远远早于GRP78的出现，呈现出时间及剂量依赖性。CHOP和XBP的改变只在MDA-MB-231细胞发现，在MCF-10A细胞中没有发现。总之，FAD诱导癌细胞内质网应激提示FAD诱导内质网应激与FAD诱导细胞死亡有关。GRP78的敲除明显增加了FAD诱导的细胞死亡水平，同时GRP78的过表达明显降低了FAD诱导的细胞死亡(Figure3F)。这些表明FAD诱导的细胞死亡是受内质网应激调控的。　　⑤FAD通过诱导细胞内蛋白质累积从而引起内质网应激促成凋亡:应用流式细胞仪可以观察到CHX能够明显抑制FAD诱导的细胞死亡。RT-PCR数据显示:在CHX和FAD处理后的细胞中CHOP和XBP1为结合聚集的水平均下降。表明FAD通过诱导蛋白聚集来引发内质网应激。　　⑥FAD与5-氟尿嘧啶和BRZ在杀死乳腺癌细胞上具有协同作用:选择MDA-MB-231乳腺癌细胞加入25 uM5-FU或BRZ10 nM联合1 uMFAD，24小时后通过流式细胞仪观察细胞死亡率。可发现联合应用FAD后抑癌作用明显增加，说明他们之间有明显的协同作用。　　结论:　　在这个研究中，我们提供了多方位的证据支持FAD通过自噬诱导乳癌细胞死亡。这些证据包括FAD处理诱导自噬，以及通过自噬抑制剂和通过敲除基因破坏自噬信号传导从而破坏自噬途径。在乳腺癌细胞中的实验我们得出结论，与FAD介导的乳癌细胞死亡与自噬相关。进一步的实验我们证明此自噬途径与内质网应激的相关性，并通过PCR技术得以充分的证明。同样采用多方位的实验证明内质网应激确实与FAD作用下乳腺癌细胞的死亡存在相关性。　　实验的最后证明了FAD与5-FU和BRZ有很强的协同作用。数据表明FAD通过增加细胞内蛋白积聚来诱导内质网应激。FAD和5-FU均可以诱发内质网应激和DNA损伤，在杀死癌细胞上表现协同作用。BRZ通过干预ERAD(内质网相关降解)诱导内质网应激，并且进一步促进它的毒性作用起到抗癌细胞作用。因此，FAD和BRZ都引发内质网应激，同时协同杀死癌细胞。　　因此我们可以说，FAD导致细胞的死亡，FAD引起的细胞死亡与caspase途径呈现相关性，另外FAD导致的细胞死亡也与自噬相关。无论是应用阻断剂还是通过敲除相关基因抑制FAD都会阻断细胞的死亡。我们进一步发现FAD相关性细胞死亡可以通过内质网应激终止，并可以通过蛋白堆积诱导内质网应激。并最终发现FAD与5-FU和Bortezomib在杀死乳腺肿瘤细胞中互相有增效作用。总之，这些数据证明FAD有很强的抗肿瘤作用，并且有潜力用于新药的开发。