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拟南芥生物钟系统的中央振荡器主要有三个重要组分:即CCAI(CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATEDI),LHY(LATE ELONGATEDHYPOCOTYL)和TOCI(TIMING OF CAB EXPRESSIOVI).CCAI瓢LHY各编码MYB相关的转录因子,TOCI是一个伪反应调节因子(PSEUDO-RESPONSE REGULATOR)。凌晨时,CCA1和LHY的转录达到高峰,其蛋白结合在TOCI启动子的夜晚元件(Evening element,EE)上协同抑制TOCI的转录。而在暗中,TOCI表达逐渐升高并在深夜选到高峰,高表达的TOCI通过一种未知的机制促进CCAI和LHY的表达并使其在凌晨达到高峰,三者形成一个反馈抑制环(Feedback loop),并有节律的振荡。
大豆是典型的短日植物,又是古四倍体,因此,研究大豆生物钟成分LHY/CCAI/TOC1,阐明其功能,对揭示大豆光周期调节及植物生物钟系统的进化和多样性具有重要意义。
本研究从大豆KN18中克隆得到的四个TOC1同源物及其启动子,通过生物信息学分析发现,大豆GmTOC1s与AtTOCI位于同一进化枝,表明它们之间的亲缘关系较近。从内含子-外显子比对分析结果可以看出,GmTOC1的四个拷贝与AtTOC1同源性较高;进一步的氨基酸序列比对发现.GmTOC1的四个拷贝及AtTOC1分别有二个外显子同时编码保守的调节区域,一个外显子都编码保守的CCT区域。由此可见,GmTOCi与AtTOC1可能具有相似的功能。
对大豆四个TOC1同源物的启动子进行生物信息学分析,发现四个启动子都具有受光诱导、激素诱导和胁迫诱导等顺式作用元件,而且和拟南芥AtTOC1启动于相比较,各类元件又具有各自的特异性;分析EE元件,发现在拟南芥AtTOC1和大豆GmTOC1-3的启动子中都具有完整的夜晚元件AAAATATCT,在大豆TOC1同源物的其他启动子中不具有完整的EE元件,但含有AAAATATNN元件,初步推测可能在进化过程中发生了EE元件后两个碱基的突变,但并不影响其正常功能。
本研究还克隆到大豆GmLCL(Glycine max L.LHY and CCA1 Like)基因的四个拷贝,对其进行了生物信息学分析,用实时定量PCR(QuantitativeReal-time RT-PCR)分析丁其在不同组织器官和发育时期的时空表达模式,并将部分基因在拟南芥中过表达研究其功能。.主要研究结果如下:
1.大豆GmLCLs基因均具有保守的MYB DNA结合域,在MYB DNA结合域上游都具有保守的丝氨酸位点;
2.GmLCL1,GmLCL2,GmLCL3和GmLCL4 mRNA表达,除开花期外,大多在其他发育时期的叶片中高水平表达,初步推测GmLCLs在大豆发育的前期和中期具有重要功能;
3.分析大豆GmLCLs总蛋白在不同发育时期和不同组织器官的表达模式,发现具有与mRNA对应的表达模式;
4.长日条件下,不同纬度来源的大豆品种GmLCLs蛋白表达量与纬度呈负相关,短日条件下的GmLCLs的表达量没有显著差别;
5.在拟南芥原生质体中瞬时表达表明大豆GmLCL1蛋白和GmLCL2蛋白均定位于细胞核;
6.过表达的拟南芥植株出现晚花表现型,初步推测GmLCL1和GmLCL2过表达可能导致生物节律的变化而延迟开花。