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背景肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)是以心肌肥厚为特征,心肌细胞肥大和肌纤维排列紊乱等是其典型表现。目前认为HCM的病因多与遗传有关,是一种常染色体显性遗传病。胚胎基因p-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)、脑利尿钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)和心房利尿钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP)等基因重新表达被认为是心脏肥厚的分子标志,检测这些基因的表达不仅可以肯定心脏肥厚的存在,而且可以判断肥厚的程度及预后。当前基因芯片技术显示,不同心肌肥厚模型引起基因表达水平的方向、数目和种类各不相同,如利用动-静脉瘘和去甲肾上腺素制备的心肌肥厚模型中,其发生变化的34个基因中有14个调节方向相反。肾上腹主动脉缩窄(renal abdominal aortic coarctation, AAC)、动静脉瘘(arteriovenous fistula, AVF)和异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)法制备的心肌肥厚模型,都是经典的且被国内外研究者广泛认可的模型,但这三种不同心肌肥厚模型间肥厚性标志基因ANP、BNP和β-MHC表达有无差异尚不清楚。因此采用AAC、AVF和ISO法制备心肌肥厚小鼠模型,检测ANP、BNP和β-MHC的表达差异,以期优选出心肌肥厚标志基因表达明显的造模方法。动物造模,离不开动物品系的选择,不同品系动物,采用相同的方法造模亦存在差异,这些差异多数是由不同的遗传背景所造成的。遗传背景不同,导致特定的基因表达水平亦不同,但目前以与人类遗传密切相关的HCM肥厚分子标志(ANP、BNP和β-MHC)为靶标,对不同品系小鼠HCM心肌肥厚模型进行筛选将产生何种影响尚不明确,因此比较不同品系小鼠心肌肥厚模型间ANP、BNP和β-MHC的表达差异性具有一定的必要性。目前治疗HCM主要方法有药物和手术治疗等。2015年版药典记载的双丹口服液,功能主治为养心活血、化瘀止痛。本课题组前期研究结果显示,双丹提取物中两种主要有效成分(丹酚酸B和丹皮酚组合的新复方,简称SP)具有协同作用,并在心肌缺血模型中观察到SP具有明显的舒张血管功能和对动-静脉瘘心肌肥厚模型小鼠具有一定的防治作用,但其防治作用与ANP、BNP和P-MHC的表达是否相关及SP作用机制尚未明确。据报道心肌肥厚与纤维化密切相关且伴随着TGF-β1表达上调,通常Smad蛋白被认为是TGF-β1信号通路下游介质之一,其中Smad2、3可促进TGF-β1刺激信号从细胞质向细胞核传导,而当前认为TGF-β1信号转导可以被Smad7抑制,Smad7可阻断信号转导,抑制相关靶基因的转录和蛋白表达,这主要是由于TGF-β1型受体被配体激活后,Smad7与激活型Smad可与其竞争性结合。因此本研究亦将探索SP对心肌肥厚小鼠ANF、BNP和β-MHC的表达及TGF-β/Smad信号通路的影响。目的1.从三种造模方法AAC、AVF和ISO中优选心肌肥厚标志性基因ANP、BNP和β-MHC表达明显的造模方式；2.从四种不同品系BALB/c、C57BL/6、ICR和KM小鼠心肌肥厚模型中,优选心肌肥厚标志性基因ANP、BNP和β-MHC表达明显的小鼠品系；3.在优选、制备理想心肌肥厚模型的基础上,探索SP对其模型小鼠ANP、BNP和β-MHC表达及TGF-β/Smad信号通路的影响。方法1.将C57BL/6小鼠随机分为对照组和模型组,造模组分别采用AVF、AAC和ISO法制备心肌肥厚模型；再取KM、ICR、C57BL/6和BALB/c四个品系小鼠分别随机分为对照组和模型组,后者均采用前面实验结果制备心肌肥厚模型。上述小鼠均在4周后,称取体重(body weight, BW),颈椎脱臼处死,称量心脏重量(heartweight, HW)和左室重量(left ventricular weight, LVW),计算心脏指数(HW/BW)和左心室指数(LVW/BW).一部分心脏组织标本分离后快速冲洗、分装,并于液氮冻存,以备后续采用qRT-PCR检测；另一部分心脏组织用生理盐水漂洗,10%甲醛固定24h后,经冲洗、脱水、硬化、透明、浸渗等步骤后进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、摄片和组织芯片制作、免疫组织化学法观察ANP、BNP和β-MHC蛋白表达。2.将上述实验优选的小鼠品系,随机分为对照组和造模组,后者采用前面实验优选的方法制备,2周后将造模组随机分为：模型,阳性药和SP大、中、小剂量组,并开始灌胃给药至第4周末。阳性药组每天按35mg/kg给予卡托普利片,SP大、中、小剂量组分别每天按60,30和15mg/kg给予SP溶液,对照组和模型组给予等容量溶媒。末次给药后2小时,称取各小鼠BW,颈椎脱臼处死,称量HW和LVW,计算HW/BW和LVW/BW。一部心脏组织分装冻存,用于qRT-PCR和Western blot检测；另一部分心脏组织HE染色、摄片和组织芯片制作、免疫组织化学法观察ANP、BNP和β-MHC蛋白表达。结果1.不同方法诱导心肌肥厚模型小鼠间ANP、BNP和β-MHC的表达差异采用AAC、AVF和ISO法制备的心肌肥厚小鼠心脏肥厚指数HW/BW、 LVW/BW显著增加,在高倍镜下,可见心肌细胞肥大、排列稀疏和间质纤维化,提示采用AAC、AVF和ISO法诱导小鼠心肌肥厚模型是成功的；与AAC法比较,ISO组HW/BW、LVW/BW和AVF组HW/BW明显减轻,AVF和ISO组小鼠心肌室壁增厚、心室腔狭窄亦较轻,提示采用AAC法制备小鼠心肌肥厚模型产生的心肌肥厚程度要优于AVF和ISO法。采用AAC和AVF法制备的心肌肥厚小鼠心脏左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平均明显增加,同样ISO法小鼠ANP和BNP mRNA转录和蛋白表达水平亦显著增加,但β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平仅有增加趋势；将三种方法AAC、AVF和ISO制备的心肌肥厚模型进行相互比较,显示AAC法小鼠左心室ANE、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平增加最明显,提示采用AAC法上调心肌肥厚模型小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白水平要优于AVF和ISO法。2.不同品系小鼠心肌肥厚模型ANP、BNP和P-MHC的表达差异采用四个品系小鼠C57BL/6、BALB/c、 KM和ICR制备心肌肥厚模型,其中C57BL/6、BALB/c、KM小鼠心脏肥厚指数HW/BW、LVW/BW显著增加,ICR小鼠HW/BW和LVW/BW仅有增加的趋势,HE染色显示四个品系小鼠心肌细胞肥大,部分肌纤维断裂,细胞间隙增加,提示采用C57BL/6、KM、BALB/c小鼠制备心肌肥厚模型是成功的,ICR小鼠不够理想；将四个品系小鼠C57BL/6、 BALB/c、KM和ICR制备的心肌肥厚模型进行相互比较,显示C57BL/6小鼠心脏肥厚指数HW/BW和LVW/BW增加最明显,其次为KM小鼠,提示采用C57BL/6小鼠制备小鼠心肌肥厚模型产生的心肌肥厚程度要优于BALB/c、KM和ICR。采用四个品系小鼠C57BL/6、BALB/c、KM和ICR制备心肌肥厚模型,其中C57BL/6、KM小鼠心脏左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平均明显增加,而BALB/c小鼠BNP和ICR小鼠ANP、BNP mRNA转录和蛋白水平仅有增加趋势；将四个品系小鼠C57BL/6、BALB/c、KM和ICR制备的心肌肥厚模型进行相互比较,显示C57BL/6小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平增加最明显,提示采用C57BL/6小鼠制备的心肌肥厚模型ANP. BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白水平要优于BALB/c、KM和ICR小鼠。3.SP对心肌肥厚小鼠ANP、BNP和β-MHC表达及TGF-β/Smad信号通路影响采用AAC法制备C57BL/6小鼠心肌肥厚模型,显示造模小鼠心脏肥厚指数HW/BW和LVW/BW明显增加,心脏体积增加,心肌细胞肥大,部分肌纤维断裂,细胞间隙增加,提示本次实验的模型是成功的；CAP和SP组大、中剂量均可使模型小鼠肥厚指数HW/BW和LVW/BW显著降低,心脏体积减小,肌纤维断裂程度减轻,细胞间隙变小,且CAP和SP比较无显著差异,提示SP可明显降低AAC法致心肌肥厚模型C57BL/6小鼠心脏肥厚指数HW/BW、LVW/BW和心肌病理性损伤,其作用强度与卡托普利片相当。采用AAC法制备C57BL/6小鼠心肌肥厚模型,显示造模小鼠心脏左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平明显增强；CAP和SP组大、中剂量均可使造模小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平明显降低,且CAP和SP比较无显著差异,提示SP可明显降低AAC法致心肌肥厚模型C57BL/6小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA转录和蛋白表达水平,其作用强度与卡托普利片相当。采用AAC法制备C57BL/6小鼠心肌肥厚模型,显示造模小鼠心脏左心室TGF-p1. Smad2和Smad3 mRNA转录水平显著增加,但Smad7 mRNA转录水平无明显差异；CAP和SP组大、中剂量均可显著下调造模小鼠左心室TGF-β1、Smad2、 Smad3 mRNA转录和Smad3蛋白表达水平,明显上调Smad7 mRNA转录和蛋白表达水平,提示SP对心肌肥厚的防治作用机制可能与调控TGF-β/Smad信号通路有关。结论1.AVF、AAC和ISO三种方法制备小鼠心肌肥厚模型,以心肌肥厚小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC表达为筛选条件,结果表明以AAC法制备的小鼠心肌肥厚模型最理想；2.心肌肥厚小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC表达为筛选条件,AAC法制备C57BL/6、BALB/c、KM和ICR四种不同品系小鼠心肌肥厚模型中,以C57BL/6品系小鼠模型最理想；3.SP明显抑制AAC法诱导的C57BL/6小鼠的心肌肥厚,抑制心肌肥厚小鼠的ANP、BNP和β-MHC的表达；4.SP抑制小鼠心肌肥厚的作用机制可能与调控TGF-β/Smad信号通路有关。