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目的:观察三七总皂苷对缺血性脑损伤中RIG-I信号通路相关分子RIG-I、Traf2和NF-κB表达的调节作用,以及对下游炎症因子INF-α、IL-8含量的影响,揭示三七总皂苷在脑缺血中发挥抗炎作用的分子机制,同时也为RIG-I信号通路参与缺血性脑损伤提供进一步实验佐证。方法:1.利用本室已建立的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)原代培养技术,将传至3代的细胞,采用氧糖剥夺(oxygen-glucose-deprivation,OGD)的方法制备拟缺血损伤模型。2.观察三七总皂苷对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞RIG-I信号通路的影响:将大鼠脑微血管内皮细胞分为四组,即正常组、模型组、三七总皂苷组和RIG-I siRNA组。除正常组外,其余各组采用OGD法造模,三七总皂苷组在造模前及过程中加入终浓度为22μg/ml的三七总皂苷;RIG-I siRNA组,在造模前采用基因转染技术,导入RIG-IsiRNA干扰RIG-I的表达,转染成功后造模。造模结束后,采用实时荧光定量PCR(RT-FQ-PCR)法和免疫印迹(Western Blot)法检测各组RIG-I信号通路中RIG-I、Traf2和NF-κB mRNA以及蛋白表达情况。3.观察三七总皂苷对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞RIG-I信号通路下游炎症因子表达的影响:细胞的分组与处理同上,采用ELISA法检测各组细胞中炎症因子TNF-α、IL-8的含量。4.观察三七总皂苷对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)激活的RIG-I信号通路的影响:为了进一步验证调节RIG-I信号通路是三七总皂苷的有效干预靶点,我们采用了另一种RIG-I通路激活模型,即LPS刺激模型,观察三七总皂昔对该模型诱导的RIG-I通路中各分子表达的调节作用。将培养至三代的大鼠脑微血管内皮细胞细胞分为三组,即正常组、LPS组和LPS+三七总皂苷组。除正常组外,其余两组加入终浓度为1μg/ml LPS,LPS+三七总皂苷组在激活前及过程中加入终浓度为22μg/ml的三七总皂苷,采用RT-FQ-PC R法和Western Blot法检测各组细胞RIG-I、Traf2和NF-κB mRNA以及蛋白表达情况。5.观察RIG-I和NF-κB在动物实验中的表达:将大鼠分为假手术组、模型组(永久大脑中动脉栓塞模型)和三七总皂苷组,其中三七总皂苷组在造模前48h、24h给药,造模后2h给药并在24h取材;假手术组和模型组在相同的时间点给药取材,但是给药为生理盐水。取材后通过免疫组化的方法检测RIG-I和NF-κB在大鼠脑内皮血管中的表达情况。结果:1.三七总皂苷对拟缺血脑微血管内皮细胞RIG-I信号通路有下调作用:氧糖剥夺模型后,RIG-I信号转导通路被激活,RIG-I、Traf2和NF-κB mRNA及蛋白表达水平明显升高;RIG-IsiRNA组上述因子表达均显著下调;与模型组相比较,三七总皂苷能够在mRNA及蛋白水平有效降低OGD诱导的RIG-I、Traf2和NF-κB高表达(P<0.05),显示了与RIG-IsiRNA相似的作用。2.三七总皂苷能够减少拟缺血大鼠脑微血管内皮细胞炎症因子TNF-a和IL-8的表达:RIG-IsiRNA能有效减少OGD后脑微血管内皮细胞中TNF-α和IL-8的表达,具有统计学意义(P<0.05),提示RIG信号通路参与了缺血性脑损伤的炎症反应过程。较模型组相比,三七总皂苷组脑微血管内皮细胞中TNF-a和IL-8的含量明显减少(P<0.05)。3.三七总皂苷对LPS诱导的BMECs RIG-I信号通路活化有下调作用:LPS刺激后内皮细胞RIG-I、TRAF2及NF-κB mRNA及蛋白的表达均升高(P<0.05)。三七总皂苷干预后RIG-I、TRAF2及NF-κB mRNA及蛋白的表达均被下调,具有统计学差异(P<0.05)。4.三七总皂苷对动物大脑中动脉栓塞模型后RIG-I和NF-κB的表达有下调作用:造模后RIG-I和NF-κB在脑微血管中表达增多,呈强阳性;给予三七总皂苷治疗RIG-I和NF-κB在脑微血管中表达明显减少,呈弱阳性。结论:1.在缺血性损伤中RIG-I信号通路被激活,继而诱导下游炎症因子TNF-a和IL-8高表达,提示该通路参与了缺血性脑损伤的炎症反应过程。2.三七总皂苷通过调节RIG-I信号通路,能够减少炎症因子TNF-a和IL-8的表达,提示抑制OGD后细胞中RIG-I信号通路的活化可能是三七总皂苷在缺血性脑损伤中发挥抗炎作用的内在机制之一。3.三七总皂苷对LPS诱导的脑内皮细胞RIG-I信号通路的活化也具有抑制作用,进一步证实RIG-I信号通路可能是三七总皂苷发挥抗炎作用的药效靶点之一。4.在动物大脑中动脉栓塞模型中,三七总皂苷亦能降低造模后大鼠脑微血管中RIG-I和NF-κB的表达,与细胞实验结果相一致。