近年来随着免疫低下人群的增多，HCMV感染及其引发的严重疾病受到重视，其中对造血系统分化和增殖的抑制又是其中的热点，本课题组自1997年以来已完成了HCMV对粒一巨噬系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)、多向造血祖细胞(CFU-Mix)、巨核系祖细胞(CFU-MK)及前髓系细胞影响的研究，证实了HCMV体外感染对它们均有抑制，并呈浓度依赖性，同时也证实了HCMV体外感染CHRF细胞、HL-60细胞可加重其凋亡，且呈剂量依赖性。随着研究的不断深入，相应地干预细胞凋亡的手段可望成为治疗此类凋亡相关性疾病的新策略，目前已有大量的临床实践表明，单独用中药或中西结合治疗此类疾病疗效确切。本试验就是在此基础上，用现代医学测试手段，从细胞学角度探讨当归多糖在体外治疗HCMV感染致人巨核系细胞凋亡中的作用，以便为临床用药治疗HCMV感染引起的血小板减少性疾病提供理论指导和依据，也为开发中药，发扬祖国的传统医学提供新的思路。 材料和方法： 1．材料 HCMV AD169株由中国武汉病毒研究所提供，效价为10<-5>TCID<,50>/ml。病毒原液分装冻存管，-80℃低温冰箱储存。CHRF-288-11细胞株、当归多糖(APS)由香港中文大学儿科系实验室提供。 2．方法 CHRF-288-11细胞株用含10﹪FBS、100单位/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的RPMI1640培养基培养，在37℃、5﹪CO2条件下培养，每周换液2次，传代1次。取对数增殖期细胞做实验。 HCMV原液直接感染A组CHRF细胞株，使其终浓度为10<-2>原液，于病毒感染后第3天加入不同浓度的当归多糖(APS)，根据加入HCMV及APS浓度的不同，实验分为五组，并设对照组。 A1大剂量APS组(CMV+LAPS) APS终浓度为200 μ g/ml． A2中剂量APS组(CMV+MAPS) APS终浓度为100 μ g/ml． A3小剂量APS组(CMv+SAPS) APS终浓度为50 μ g/ml． A4对照组未加入APSB 空白组未加入HCMV 未加入APS然后于不同时间收集各组细胞，分别进行凋亡检测。 (1)PCR扩增在病毒感染A组后第3天收集各组细胞，抽提DNA，做PCR扩增检测HCMV IEA，电泳后观察是否有特异性阳性条带，以鉴定HCMV是否直接感染CHRF细胞株。并分别向各组加入不同浓度当归多糖。 (2)Hoechst染色对不同时间的各组细胞进行染色，即刻在荧光显微镜下观察细胞形态。细胞内核DNA出现不同程度固缩、碎裂的细胞即为凋亡细胞。 (3)MTT法收集不同时间的各组细胞，加入MTT显色后，在酶标仪检测光密度值，计算细胞存活率。 (4)DNA ladder收集不同时间的各组细胞，常规抽提DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否有特征性凋亡梯形条带。 (5)AImexin V/PI双染流式细胞仪分析收集不同时间的各组细胞，每组至少10<6>个细胞，PBS清洗、离心，加入Annexin V/FITC和碘化丙锭溶液，混匀后避光染色；同时以不加Amlexin V/FITC及PI的为对照，用400目丝网过滤后，即刻用流式细胞仪分析检测凋亡细胞。 结果： 1．PCR扩增后，在2﹪的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下可见HCMV IEA特异性扩增条带。 2．在HCMV感染CHRF细胞后第3、5、7天，通过Hoechst染色在各组可观察到不同程度的凋亡细胞，而在其对照组凋亡细胞则相对较多。 3．在A组中，于HCMV感染的第3天加入APS后，对不同时间的细胞进行MTT法检测，记录细胞存活率(﹪)。第5天，CMV+LAPS组86.46±5.11， CMV+MAPS组76.57 ±5.78，CMV+SAPS组66.17±4.24，对照组55.94±5.05，空白组117.50±4.31；第7天，CMV+LAPS组76.66±3.13，CMV+MAPS组65.57±7.22，CMV+SAPS组54.48 ±4.27，对照组43.40±6.94，空白组131.83±7.22。结果显示在HCMV感染的A组细胞中，随着加入当归多糖剂量的增加，细胞存活率有上升的趋势。 4．在病毒感染后第5天，收集各组细胞抽提DNA，经电泳可见各组的特征性梯形条带，在HCMV感染的A组中随着加入当归多糖剂量的减少，条带逐渐清晰。 5．在A组中，于HCMV感染的第3天加入APS后，Annexin V/PI染色观察凋亡细胞，记录凋亡率(﹪)。第5天，CMV+LAPS组26.10±1.99，CMV+MAPS组30.11±1.85， CMV+SAPS组34.79±1.79，对照组37.84±0.97，空白组10.34±0.84；第7天， CMV+LAPS组38.70±1.37，CMV+MAPS组43.22±1.51，CMV+SAPS组47.71±2.78，对照组52.20±3.38，空白组19.42±2.88。从结果可观察到，在HCMV感染的A组中随着加入当归多糖剂量的减少，凋亡率呈上升趋势。 结论： 1、HCMV ADl69株在体外可直接感染巨核系细胞并降低其存活率。 2、HCMV ADl69株在体外感染巨核系细胞后可诱导其加重凋亡，其凋亡率与时间呈正相关。 3、在HCMV ADl69株体外感染巨核系细胞后，向培养细胞中加入当归多糖，可以提高受染细胞的存活率，表明当归多糖对}tCMV感染的巨核系细胞有一定的保护作用。 4、当归多糖在一定程度上能抑制HCMV体外感染诱导的巨核系细胞凋亡，且呈剂量依赖性。