目的明确华支睾吸虫感染能否诱导肝星状细胞自噬发生,进一步阐述该自噬水平的变化在华支睾吸虫感染所致肝纤维化发生中所起作用。方法1.华支睾吸虫感染所致自噬与肝纤维化间关系研究构建华支睾吸虫感染模型,麦穗鱼消化获取华支睾吸虫囊蚴,SD大鼠随机分为感染组与对照组,每组各10只,感染组大鼠每只经口灌胃囊蚴100只,对照组灌胃等量生理盐水。感染后24周处死大鼠,取病变部位肝组织,石蜡包埋切片,HE染色和Masson染色观察组织病理变化及纤维组织增生,按Metavir肝组织纤维化分期评分;提取肝组织总蛋白,Western blot检测肝组织自噬相关蛋白LC3、P62及肝纤维化相关蛋白α-SMA变化。2.华支睾吸虫分泌-排泄蛋白（ESP）对肝星状细胞自噬影响采用兔经口灌胃囊蚴获取成虫,收集体外培养6 h和12 h培养液,即华支睾吸虫ESP;收集完整有活力成虫,组织破碎仪破碎后离心,取上清,即为华支睾吸虫成虫蛋白（Cs TP）;体外常规培养LX-2细胞,双荧光标签e GFP-m RFP-LC3质粒转染LX-2细胞观察自噬,将转染后细胞分为空白组、转染对照组、6 h华支睾吸虫ESP组、12 h华支睾吸虫ESP组、Cs TP组、阳性对照组,继续常规培养6 h,荧光显微镜下拍照计数荧光点数,统计学分析;蛋白电泳观察组分差异,探讨各组诱导自噬能力差异原因。3.华支睾吸虫ESP所诱导自噬在肝纤维化中作用研究体外常规培养LX-2细胞,ESP按照25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml浓度梯度加入培养基,对照组等体积加入PBS,于6 h、12 h、24 h、36 h、48h收样,Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值变化确定华支睾吸虫ESP诱导LX-2细胞自噬时间点;华支睾吸虫ESP和氯喹联合刺激LX-2细胞,反向证明华支睾吸虫ESP可以激活LX-2细胞自噬,提取LX-2细胞样品总蛋白,Western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值变化观察各组自噬情况;观察华支睾吸虫ESP对LX-2细胞肝纤维化相关基因表达影响,实验组加入含100μg/ml华支睾吸虫ESP的10%FBS培养液,对照组为10%FBS培养液,分别于6h、24 h、48 h收取总RNA样品,q RT-PCR检测肝纤维化相关基因Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA的表达变化;使用氯喹干预自噬过程验证华支睾吸虫ESP通过自噬影响肝纤维化相关基因表达,实验分为华支睾吸虫ESP处理组、氯喹+华支睾吸虫ESP处理组及空白组,在加样后6、24、48小时收集LX-2细胞,提取总RNA,q RT-PCR检测肝纤维化相关基因Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA的表达变化,结果进行统计学分析。结果1.感染SD大鼠均检获华支睾吸虫,成功构建大鼠感染模型。感染组大鼠病理结果提示肝组织出现纤维化病变。根据Metavir评分系统,对照组大鼠肝脏7只处于F0阶段,仅3只处于F1阶段;感染组大鼠4只处于F1阶段,6只处于F2阶段。Western blot结果显示感染组10只大鼠中有6只存在自噬水平升高同时,纤维化相关蛋白表达水平也随之升高。感染后肝组织自噬变化与肝纤维化两者之间可能存在联系。2.荧光转染实验中,6 h华支睾吸虫ESP组、12 h华支睾吸虫ESP组、成虫蛋白组相比较,红、黄色荧光点数依次减少,即激活自噬能力依次下降,但都高于对照组（P<0.01）。蛋白电泳结果显示,6 h和12 h收集到的华支睾吸虫ESP主要蛋白条带在26KDa左右处,成虫蛋白呈现瀑布样分布,主要蛋白条带位于70KDa左右和26KDa左右处;6 h华支睾吸虫ESP、12 h华支睾吸虫ESP、华支睾吸虫成虫蛋白在26 KDa左右蛋白含量依次降低,与各组激活自噬能力变化一致,两者可能具有相关性。华支睾吸虫ESP具有更强激活细胞自噬能力。3.Western blot结果显示华支睾吸虫ESP处理LX-2细胞在6 h和48 h的自噬水平升高,其余时间点未见自噬激活;CQ+ESP组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值较CQ组上升,Cs ESP可以诱导细胞自噬发生;q RT-PCR检测结果显示,华支睾吸虫ESP刺激LX-2细胞48 h,肝纤维化相关蛋白Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ的m RNA表达升高;华支睾吸虫ESP与氯喹联合刺激LX-2细胞,华支睾吸虫ESP可以恢复由于氯喹抑制自噬引起的肝纤维化相关基因表达下降。结论明确华支睾吸虫分泌-排泄蛋白（ESP）具有激活肝星状细胞自噬作用,所诱导自噬能促进肝纤维化相关基因表达,显示自噬在华支睾吸虫感染致肝纤维化发生中发挥一定作用。