肉类含有许多重要的蛋白质成份,它是人类营养物质的主要来源之一,对肉品质的改善将有利于提高消费者对肉的接受与感知能力,促进肉类的消费。因此,肉品质的好坏将直接影响到整个生猪产业的可持续发展。在过去的几十年里,传统的育种方法有效的提高了猪的生长率、饲料转换率与瘦肉率,而对这些性状的强度选择却使猪产生了严重的不良反应,如行为异常、生理功能紊乱、免疫能力下降等,另外在肉品质方面则增加了PSE肉,降低了肌内脂肪的含量。目前众多的研究认为遗传因素是影响肌肉品质的主要因素,然而对于遗传因素影响肌肉品质的分子机理还不是很清楚。肌肉是猪胴体重的主要组成部分,它的生长直接决定着猪的生长速率。肌肉的基本组成单位是肌纤维,而不同的肌纤维类型直接影响到肌肉的品质特性(肉色、pH值、嫩度、肌内脂肪、系水力、风味等)。因此,深入了解肌肉的生长发育规律,肌纤类型的形成与转换机制将有助于揭示肌肉品质形成的分子机理。先前的研究表明,Sixl与Pitx2c基因是两个与肌肉的形成有着密切联系的转录因子。因此,本研究将这两个转录因子作为影响猪生长与肌肉品质的重要候选基因,从两个基因的分离克隆着手,全面分析了两个基因的表达模式,进一步分析了两个基因的多态性与猪生产性状的关系,并在细胞水平对Sixl基因的表达调控机制进行了系统的研究。本研究所取得的结果为揭示猪肌肉品质形成的分子机理提供了更多的理论依据。所取得的主要结果如下：1.利用PCR与RACE等技术分离克隆了猪Sixl基因与Pitx2c基因。其中所分离的Sixl基因全长为4248bp,cDNA全长为2201bp；所分离的Pitx2c基因cDNA全长为2316bp,并分离了该基因的第一内含子序列,其序列长为1482bp。2.对这两个基因在猪中的表达模式进行了全面的分析,包括在不同组织中的表达模式,在背最长肌不同发育阶段的表达模式,以及在不同肌肉中的表达模式。(1)利用半定量RT-PCR分析了猪Sixl与Pitx2c基因在不同组织中的表达情况。结果显示,猪Sixl与Pitx2c基因两个均是骨骼肌高表达的基因；(2)利用real-time PCR分析Sixl与Pitx2c在不同发育阶段的表达模式。结果表明,两个基因在胚胎65天均具有较高的表达水平,在出生后60天与120天中,Sixl基因在大白猪中的表达水平要显著高于梅山猪。而Pitx2c基因在大白猪胚胎65天、出生后21、60与120天的表达水平均要高于梅山猪。(3)同样利用real-time PCR分析了两个基因不同肌肉中的表达模式。结果表明,两个基因在快肌股二头肌中的表达均要高于其它几种所检测的肌肉。3.对这两个基因中的多个SNP位点在不同猪中的遗传多样性进行了分析,并利用本实验室建立的大梅F2代资源家系分析它们对经济性状的遗传效应。所分析的猪Sixl基因的多态位点包括：(1)内含子1595bp处的A/G转换突变,关联分析的结果显示该突变位点的多态性与背最长肌肉色(MCV1)(P<0.05)、背最长肌大理石纹(MM1)(P<0.01)以及屠宰率(DP)(P<0.05)存在显著或极显著的相关；(2)启动子136bp处的C/T转换突变(位置相对于转录起始位点),该突变位点的多态性与股二头肌肉色值(MCV2)(P<0.05)、背最长肌肌内脂肪(IMF)(P<0.05)、肩部最厚处背膘厚(SFT)(P<0.05)以及瘦肥比例(RFL)(P<0.05)存在显著相关(P<0.05)；(3)启动子1363bp处的C/T转换突变(位置相对于转录起始位点)该突变位点的多态性与股二头肌pH值(P<0.05)、背最长肌pH值(P<0.05)、失水率(DLR)(P<0.05)、系水力(WHC)(P<0.05)和皮率(SP)(P<0.05)呈显著相关。所分析的猪Pitx2c基因的多态位点包括：(1)编码区的2个无义突变,474bp处C/T突变与636bp处的C/T突变(位置相对于翻译起始位点)；连锁不平衡分析显示,这两个位点处于紧密连锁状态(r2=0.85),关联分析结果表明,这两个位点的多态性与背最长肌肉色均存在显著或极显著相关；(2)3’UTR的2个突变,37bp处G/A突变与47bp处G/A突变(位置相对于翻译终止位点),连锁不平衡分析显示,这两个位点也处于紧密连锁状态(r2=0.95),关联分析结果表明,这两个位点的多态性与背最长肌失不率(DLR)、背最长肌系水力(WHC)以及背最长肌肉色(MCV1)呈显著相关(P<0.05)。单倍型分析结果显示,单倍型与MCV1存在显著相关(P<0.05),并且两拷贝的单倍型-CCGG-有利于肉质的改善。4.采用嵌套缺失法,利用双荧光素酶报告系统对猪Sixl基因的核心启动子序列进行了鉴定,并分析了转录因子MyoD对启动子活性的影响,并进一步初步鉴定了该启动子甲基化水平对启动子活性的影响。实验的结果表明,Sixl基因的核心启动子区位于-360bp/+170bp处,该区域包括两种常见的上游启动子元件GC框与CATT框。在三种真核细胞中所获得的实验结果显示,除了P2-530启动子(-360bp/+170bp)外,其它启动子片段在小鼠成肌细胞中(C2C12)的活性均显著或极显著的高于其它两种细胞(C3H10T1/2与PK15)。有趣的是,Sixl基因在小鼠成肌细胞(C2C12)分化后表达水平出现了下调,而猪Sixl基因启动子在分化后的C2C12细胞活性则有了明显降低。另外,共转染实验结果显示,共转染MyoD转录因子可促进Sixl基因启动子活性。体外甲基化实验的初步结果表明,Sixl基因启动子的甲基对启动子的活性具有抑制作用。5.分析了猪Sixl基因启动(Region 1)与第一外显子(Region 2)CpG岛区域在不同组织、不同肌肉中甲基化的差异。8种不同组织的甲基化分析结果显示,Region1与Region 2中各位点的平均甲基化水平均在肌肉中最低；3种不同的肌肉的分析结果显示,Region 1中2个甲基化位点的平均甲基化水平在咬肌中最低,而Region 2中10个位点的平均甲基化水平在股二头肌均要低于其它两种肌肉。6.对猪Sixl基因不同氨基酸的缺失序列进行了亚细胞定位,定位的结果表明,CDS全长与HD保守结构域主要定位在细胞核中；ND 3’端无结构域区与HD+ND结合区的定位偏向于细胞核,而SD结构域的定位则趋向于细胞质中。7.在小鼠成肌细胞系C2C12细胞,利用过表达技术分析了Sixl基因对生肌调控网络中的影响。分别采用瞬时转染与稳定转染进行了试验,两次试验的结果表明,过表达Sixl基因可促进生肌决定因子Myf5、myogenin与MyoD,快肌基因Atp2al、Srl与Mylpf的表达上调。Sixl、Pitx2c与Pax3基因均是生肌决定因子MRFs的上游调控基因,过表达Sixl基因并没有引起Pitx2c与Pax3基因的表达变化。8.利用MTT法与流式细胞仪检测方法分析了Sixl基因对细胞增殖与细胞周期的影响。MTT实验结果显示,在过表达Sixl基因的小鼠成肌细胞C2C12中,培养48h后成肌细胞的生长开始受到抑制,培养72-96h后细胞的增殖受到了明显的抑制。进一步采用稳定转染与瞬时转染初步研究了Sixl基因对细胞周期的影响,稳定转染的实验结果显示,Sixl基因对细胞周期的影响表现为使细胞停滞在G2期；瞬时转染的结果显示,Sixl基因对细胞周期的影响表现为使S期的细胞减少与G1细胞的增加。