论文部分内容阅读
目的 1.检测溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎伴不典型增生及溃疡性结肠炎相关性大肠癌组织中p53、K-ras、hMSH2蛋白的表达状况,并进行差异显著性分析,以探讨这三种蛋白相关基因在溃疡性结肠炎相关性大肠癌发生发展过程中的作用;2.检测溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎伴不典型增生及溃疡性结肠炎相关性大肠癌组织中的微卫星状态,以明确微卫星不稳定性在溃疡性结肠炎相关性大肠癌发生中的作用;3.检测溃疡性结肠炎伴不典型增生和溃疡性结肠炎相关性大肠癌组织中hMSH2基因启动子区域甲基化状态,分析其与hMSH2蛋白缺失、微卫星不稳定性的相关性,以进一步了解溃疡性结肠炎相关性大肠癌发生发展过程中的分子生物学变化。方法 第一部分 溃疡性结肠炎及相关性大肠癌组织中p53、K-ras、hMSH2蛋白表达 实验组:溃疡性结肠炎25例,溃疡性结肠炎伴不典型增生7例,溃疡性结肠炎相关性大肠癌8例;对照组:散发性大肠癌30例,慢性结肠炎14例。应用免疫组化S-P法染色,结果判定标准:显微镜下观察,以腺体细胞或肿瘤细胞胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性信号。突变型K-ras效应产物分布于胞浆中,p53、hMSH2效应产物分布于胞核中。高倍镜下计数10个独立视野(200X)中的100个细胞,对阳性细胞所在百分比进行评分,(1%-10%为1分,11%-50%为2分,51%-74%为3分,≥75%为4分),同时对染色强度进行评分(浅黄色为1分,棕黄色为2分,深棕色为3分),两者乘积≥3者为阳性。分析组间差异性。 第二部分 溃疡性结肠炎及相关性大肠癌组织中微卫星不稳定性分析 实验组:溃疡性结肠炎25例,溃疡性结肠炎伴不典型增生7例,溃疡性结肠炎相关性大肠癌8例;对照组:散发性大肠癌30例。应用激光捕获调出溃疡性结肠炎伴不典型增生、溃疡性结肠炎相关性大肠癌组织中的腺细胞与瘤细胞和炎性细胞与间质细胞(作为对照);应用纤维切割的方法获得溃疡性结肠炎组织中的腺细胞和炎性细胞与间质细胞(作为对照);上述方法获得的细胞用一步法提取DNA。应用酚一抓仿法提取散发性大肠癌中癌组织和相应的淋巴结组织(作为对照)的DNA。应用聚合酶链式反应一单链构像多态性方法(PCR一SSCP)检测溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎伴不典型增生及溃疡性结肠炎相关性大肠癌组织中的微卫星状态(6个位点:LNSCA、MDF41、D18弘7、D25123、D3S1317、 D13S158)。结果判定标准:与正常组织相比,若肿瘤组织DNA出现电泳带的移位、缺失或额外新的电泳带即确定为该位点微卫星不稳定。分析组间差异性及微卫星不稳定性与hMSHZ蛋白表达缺失的相关性。 第三部分溃疡性结肠炎相关性大肠癌组织中hMSHZ基因启动子区域甲基化测定 实验组:溃疡性结肠炎伴不典型增生7例,溃疡性结肠炎相关性大肠癌8例;对照组:散发性大肠癌30例。应用DNA甲基化敏感性限制性内切酶饰an消化DNA,37℃水浴4小时后,hMSHZ基因启动子区域PCR扩增。甲基化分析:取8泌PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,若出现扩增带(107bp),则所检测的组织存在甲基化,否则为非甲基化。同样的标本在无HPan酶切情况下作相同的处理(作为对照)。分析hMSHZ基因启动子区域甲基化与hMSHZ蛋白表达缺失的相关性。 统计学方法:用xZ检验,分析组间差异性,检验水准。=0 .05(双侧),全部数据用SPSS 10.0 for Windowo95软件包进行分析,p<0.05时为差异有统计学意义,p<0.01时为差异显著。结果 户3蛋白过表达的阳性率在溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎伴不典型增生、溃疡性结肠炎相关性大肠癌、散发性大肠癌、慢性结肠炎等不同组织中分别为:4%、44.44%、85.71%、60.61%和0%。统计学分析表明:户3蛋白过表达率在溃疡性结肠炎与慢性结肠炎、溃疡性结肠炎相关性大肠癌与散发性大肠癌、溃疡性结肠炎伴不典型增生与溃疡性结肠炎相关性大肠癌组间的差异无统计学意义。但在溃疡性结肠炎与溃疡性结肠炎伴不典型增生组间的差异有统计学意义(p<0.05),溃疡性结肠炎与溃疡性结肠炎相关性大肠癌组间的差异显著(p<0.01)。 突变型K一ras蛋白表达的阳性率在溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎伴不典型增生、溃疡性结肠炎相关性大肠癌、散发性大肠癌、慢性结肠炎等不同组织中分别:为16%、57.1%、86.3%、80.0%和14.3%。统计学分析表明;突变型K一ras蛋白表达的阳性率在溃疡性结肠炎与慢性结肠炎、溃疡性结肠炎相关性大肠癌与散发性大肠癌、溃疡性结肠炎伴不典型增生与溃疡性结肠炎相关性大肠癌组间的差异无统计学意义。但在溃疡性结肠炎与溃疡性结肠炎伴不典型增生组间的差异有意义(p<0.05),溃疡性结肠炎与溃疡性结肠炎相关性大肠癌组间的差异显著(p<0 .01)。 hMSHZ蛋白表达的缺失率在溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎伴不典型增生、溃疡性结肠炎相关性大肠癌、散发性大肠癌、慢性结肠炎等不同组织中分别为:8%、0%、50%、43.3%和7.1%。统计学分析表明:hMSHZ蛋白缺失率在溃疡性结肠炎与慢性结肠炎、溃疡性结肠炎相关性大肠癌与散发性大肠癌、溃疡性结肠炎伴不典型增生与溃疡性结肠炎相