研究背景重型肝炎病情危重，预后，凶险，其治疗是临床上一大难题。生物型人工肝（bioartificial liver,BAL）理论上讲可以代偿肝脏的全部功能，构建BAL已经成为人工肝研究领域治疗重型肝炎的热点。生物反应器是生物人工肝的核心装置。目前应用最多的是中空纤维生物反应器，但是难以放大且半透膜致使物质弥散障碍等都限制了其应用。微囊肝细胞培养的流化床反应器是必然的选择。BAL欲得到临床应用，必须容易“放大”，约需10¹⁰数量级的肝细胞数。传统体外培养方法难以达到，另外还必须解决免疫排斥问题。生物微胶囊具有选择性物质通透性，允许营养成分及小分子物质自由通过，并且有免疫隔离效果。目前微囊技术已广泛用于生物人工肝研究。目前转瓶大规模微囊肝细胞培养国内外均未见报道，而适合微囊肝细胞的反应器为流化床式生物反应器，流化床的流化作用能使体外循环液充分接触微囊化肝细胞进行物质交换和物质代谢。传统的固化床液体流动时具有剪切力大，物质交换效率低，易于形成无效腔和死腔等缺点。并且其结构多为圆柱体状，液体流化时的不均一性，存在边际效应，导致无效腔形成。我们设计并研制了一种基于改善流化床反应器径向传递性能及混合效果和便于规模化应用的一套漏斗形新型结构流化床反应器。本研究旨在建立微囊永生化肝细胞大规模高活性培养体系；构建新型漏斗形流化床式反应器及对其结构参数的研究；使用体外培养基循环以及重型肝炎血浆模型对此构建的生物反应器进行体外评价，为今后进一步实验提供理论基础。第一部分微囊化永生化肝细胞的大规模转瓶培养及评价目的：本研究旨在建立一种大规模海藻酸／壳聚糖（AC）微囊化肝细胞的转瓶培养体系，并对大规模微囊化肝细胞进行功能评价研究。方法：AC微囊的表征测定（机械强度、物质渗透性免疫隔离作用）、一步法大规模包裹制备微囊永生化肝细胞，微囊肝细胞与裸细胞转瓶培养20天，动态评价微囊肝细胞增殖能力及物质代谢功能。结果：AC微囊能承受高速振荡剪切力的作用而保持形态完整；不仅能对小分子物质如白蛋白自由通过，而且阻止免疫球蛋白的释放。与裸细胞培养比较，大规模转瓶培养AC微囊肝细胞能改善细胞的生长代谢及功能（白蛋白合成、氨代谢以及利多卡因清除能力）。结论：建立了一种大规模AC微囊化肝细胞的转瓶培养体系；一步法大规模制作的AC微囊性能可靠；转瓶培养微囊化肝细胞功能在2周左右达到最佳状态，此培养模式的建立有应用生物人工肝支持系统的广阔前景。第二部分新型漏斗形流化床式反应器初步研制及结构参数研究目的：本研究旨在设计一种符合流体力学的漏斗形生物反应器，通过微囊置于反应器中在模拟体外循外灌流状态下摸索反应器的适宜流化参数。材料与方法：自行设计一定高度和锥度的漏斗形流化床式生物反应器，计算反应器结构参数；观测微囊在流化床流化状态的变化情况。排液体积法测定循环液气含率，测定流化床表观速率、最佳流化高度、观察微囊流化8小时后的完整性。结果：自行设计的漏斗形反应器容积约550ml，高度25cm，锥度92达到最佳流化状态大致分四个过程：固化床、起始流化床、循环床、完全循环流化床。流化床的气含率随着微囊的固含率增加，气含率随之增加，300g／L微囊固含率时气含率达到最大，而后固化率增加气含率缓慢下降。最佳流化高度为23 cm时，泵速为85ml／min，微囊的流化速率为1．19cm／s。流化8小时，微囊完整性在97％以上。结论：流化床式反应器作为承载微囊化人工肝适宜的生物反应器，流化床的流化参数直接影响到流化效果，对这些参数的探索对今后微囊流化床生物反应器的应用于生物人工肝研究具有指导意义。第三部分新型微囊漏斗形流化床式反应器体外初步评价目的：应用培养基循环验证流化床反应器流化作用对肝细胞功能代谢的影响；应用废弃重型肝炎血浆模型对新构建的生物反应器进行评价，观察流化床微囊化肝细胞对重肝血浆的代谢作用以及二者的相互影响。为下一步动物实验奠定基础。材料与方法：正确建立体外循环，将培养2周的微囊化肝细胞分为两组（培养基体外培养组和流化床组），实验组微囊肝细胞置于流化床式生物反应器中，DMEM高糖完全培养基1000ml体外循环12小时，动态检测上清中的ALT、LDH以及白蛋白的水平；重型肝炎血浆置换术后的被置换血浆，作为微囊生物人工肝治疗的血浆模型。将总量约5×10⁹活率在90％以上的微囊肝细胞置于流化床反应器，稀释50％的血浆体外循环6小时，实验前后测定血浆中ALT、TBi、DBi、ALB变化以及微囊肝细胞的活性以及电镜观察肝细胞的微观结构变化情况。结果：体外培养基循环12小时的评价中ALT、LDH水平均有上升，静止培养组ALT上升更为明显，两组相比有显著性差异（H4，p＜0．01；H6，p＜0．05；H12，p＜0．01）。两组白蛋白的合成均有不同程度增多，流化床组升高更为明显（H6，p＜0．01；H12，p＜0．05），与此同时，静止培养组和流化床组从6小时后白蛋白合成量较前比较明显增多，差异有统计学意义（p＜0．05或者p＜0．01）。微囊流化床组实验前肝细胞活率平均为93．5±3．2％，循环12小时后肝细胞活率为90．6±6．5％（P＞0．05）。而培养基静止培养组实验前肝细胞活率平均为93．9±4．4％，实验结束后微囊肝细胞活率略有下降，平均为87．8±3．8％，但没有统计学意义。废弃血浆体外循环功能评价显示：微囊流化床流化6小时后ALT水平无明显上升，静止培养组ALT有明显的升高，两组相比有显著性差异（H6，p＜0．05），而静止培养组中ALT水平较实验前有明显上升（p＜0．05）。体外静止培养组治疗前后总胆红素及直接胆红素无明显下降；而漏斗形流化床组则6小时体外循环后相比静止培养组有明显的下降（p＜0．05）。此外，漏斗形流化床组在治疗前后胆红素也有一定程度下降（p＜0．05），具有统计学意义。两组中白蛋白无明显变化。微囊流化床组循环6小时后肝细胞活率有明显下降（p＜0．05）；静止培养组实验结束后微囊肝细胞活率明显下降，有显著性差异（p＜0．01）。两组在实验结束后活率比较，静止培养组肝细胞活率下降明显，具有显著性差异（p＜0．05）。废弃血浆静止培养的微囊化肝细胞实验结束后肝细胞有明显的损害，出现了空泡性结构。而反应器流化组在实验结束后肝细胞细胞器清晰可见，生长状态尚可，无明显的空泡形成。结论：新构建的漏斗形流化床式生物反应器能使微囊化肝细胞在体外有效地保持活性和功能。载有以大规模微囊化肝细胞接种的漏斗型流化床式生物反应器为基础的的生物人工肝对重肝血浆中的胆红素等有害物质有效清除作用，同时流化床的流化作用对肝细胞有保护作用。建立了评价反应器的体外完整的评价体系，为今后进一步动物实验打好基础。