研究背景:宫腔粘连综合征(Asherman’s syndrome,AS)是多种因素引起子宫内膜基底层损伤,功能层再生修复障碍,形成以内膜纤维化为特征的子宫壁间粘连,是子宫性不孕症最常见的原因,在不孕症患者中占比高达25-30%;在我国,随着宫腔手术特别是无痛人流数量的上升,宫腔粘连及子宫内膜纤维化的发生率明显增高。目前主要治疗方式是手术分离粘连,并放置宫内节育器或球囊或生物材料阻隔子宫前后壁,预防再粘连。但是,这些治疗方式对重度宫腔粘连的疗效不佳,再粘连的发生率仍高达62.5%,且即使不再粘连,内膜纤维化仍然是影响胚胎着床的严重障碍。近年来,随着再生医学中干细胞研究的深入,以及成体干细胞促进难治性溃疡愈合的研究,促使我们从再生医学干细胞治疗角度探索采用干细胞修复严重损伤的内膜的可能。本研究组前期利用自身骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclearcells,BMNC,包含造血干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞等)负载于胶原支架上,使得子宫局部富集高浓度细胞,在宫腔内局部移植治疗AS的小样本研究获得良好的结果。为便于未来细胞治疗的标准化,本研究组利用子宫壁全层损伤的大鼠模型观察人脐带间充质干细胞(UC-MSC)的修复作用,观察到其促进损伤修复的良好效果。为了进一步证明人UC-MSC复合胶原支架促进子宫损伤修复的作用,本研究采用子宫内膜剥离损伤的小型香猪模型,研究胶原支架复合人UC-MSC促进修复的作用,评估胶原支架脐带间充质干细胞修复子宫内膜的效果。研究过程中我们获得“中国第一株临床使用级UC-MSC”(国家干细胞中心提供),经过南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准,进行了临床小样本注册研究并初步探究了 AS的分子病理特征。第一章胶原支架负载自体骨髓单个核细胞通过降低子宫内膜的ANp63表达来促进宫腔粘连综合征患者子宫内膜的修复和重建目的:通过体内体外等实验证实子宫内膜上皮细胞中异常表达的ANp63可以引起内膜静息,是宫腔粘连综合征发生发展的关键分子,并且可作为治疗的靶向分子。方法:HE染色分析宫腔粘连综合征患者子宫内膜组织的病理学结构特征;免疫组织化学染色(△Np63,ERα,vimentin,IGF1,Ki67,Oct4,Nanog,Sox2,KLF-4,SSEA-1,LGR5和W5C5)评估患者子宫内膜增殖分化状态和干细胞特性;COS-7细胞和原代子宫内膜上皮细胞转染△Np63腺病毒,检测两种细胞高表达△Np63后细胞的增殖分化干性状态的改变;骨髓单个核细胞与高表达△Np63的COS-7细胞和原代子宫内膜上皮细胞共培养,观察是否能够逆转△Np63高表达所带来的改变;5位年龄在27-38岁之间患有重度宫腔粘连综合征的患者倍招募进入了胶原支架负载自体骨髓单个核细胞移植治疗的临床研究中。所有临床检查和手术均在月经周期的增殖晚期进行,以优势卵泡的大小在18-20mm之间作为增殖晚期的指标。采集了患者病史、治疗经历,在治疗前和治疗后3个月的月经量变化、内膜厚度(多普勒超声测量)、宫腔镜下粘连程度和评分(美国生殖协会宫腔粘连评分表,AFS),以及内膜活检组织的免疫组织化学染色等信息进行治疗有效性的评估。受试者入组后接受宫腔镜检查和多普勒超声,获得治疗前自然周期子宫内膜厚度及粘连评分,取少量子宫内膜组织并记录所取组织的位置。在治疗前10天开始,患者口服补佳乐,剂量为6mg/天;移植治疗当天,患者接受超声检查确定月经周期后,局麻下采取自体骨髓50-80ml,分离出单个核细胞后置于大小为4cm×6cm的胶原支架上并孵育,随后患者接受宫腔镜检查并植入负载有自体骨髓单个核细胞的胶原支架,并超声确认胶原支架位置。治疗后继续服用相同剂量补佳乐30天,并在第30天加用孕酮60mg。移植治疗三个月后患者回访接受宫腔镜和超声检查,获得治疗后子宫内膜厚度及宫腔镜下粘连评分,在治疗前同样部位取少量子宫内膜组织。随后密切随访受试者月经量、内膜厚度变化及妊娠结局。结果:(1)在重度宫腔粘连综合征患者的残存子宫内膜组织的上皮细胞中有显著地△Np63高表达;高表达的△Np63与细胞增殖分化能降低、细胞干细胞特性改变相关,具体表现为:Nanog和SSEA-1表达下降,W5C5、KLF4和LGR5的表达升高,子宫内膜进入静息状态。(2)体外实验中,过表达△Np63的COS-7细胞和原代子宫内膜上皮细胞表现出类似的增殖分化受阻,表现出细胞干性相关细胞表面分子差异性表达,并且这一现象与重度宫腔粘连综合征患者的内膜组织所呈现出的变化相一致。(3)骨髓单个核细胞使△Np63阳性的子宫内膜上皮细胞的△Np63 mRNA水平下降;同时,与骨髓单个核细胞共培后,高表达△Np63的子宫内膜上皮细胞的CCND1,Ki67,ERα和IGF1的表达量显著升高。(4)接受胶原支架负载自体骨髓单个核细胞移植治疗后的重度宫腔粘连综合征患者的内膜增厚,月经量增多,宫腔粘连评分下降;术前术后内膜组织分子学检测表明,治疗后子宫内膜中△Np63表达量显著下降,细胞增殖分化能力增加,细胞干细胞特性转为正常内膜细胞的模式,表明了骨髓单个核细胞能够逆转△Np63所引起的子宫内膜功能的改变;而治疗后,患者在内膜厚度达到6mm后尝试自然受孕或者体外人工授精及胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET),5 位患者均成功受孕,并顺利生产,无胎盘并发症出现。结论:△Np63参与宫腔粘连综合征的发病机制,而子宫内膜上皮细胞异常高表达的△Np63可能是影响宫腔粘连综合征患者子宫内膜再生性修复能力的关键分子。骨髓单个核细胞能够逆转△Np63所引起的子宫内膜功能受损,使得受损的子宫内膜从静息状态中恢复,为临床治疗宫腔粘连综合征提供了新的思路。第二章胶原支架复合人脐带间充质干细胞对小型香猪子宫内膜损伤后新鲜创面修复作用目的:研究复合人脐带间充质干胶原支架对小型香猪子宫内膜剥离损伤模型的修复作用。方法:本研究包括小型香猪41只,共分为四组:假手术组,自然修复组(子宫内膜剥离后不进行干预修复),胶原支架/PBS组(子宫内膜剥离后用空白胶原支架修复),胶原支架/脐带间充质干细胞组(子宫内膜剥离后用复合人脐带间充质干细胞的胶原支架修复),每组再分为切片组和生育组。切片组动物术后8周和12周分别开腹观察子宫修复状况,有无外翻,腹腔粘连程度,宫腔是否通畅等。将无外翻、创面修复完全的子宫取出,进行组织学检测,包括HE染色,免疫组化染色等。手术组动物在损伤修复后12周进行交配,在妊娠晚期(100天左右)终止妊娠,观察手术区域胎盘着床及胎仔发育情况,比较各组手术区域胎盘着床率等。结果:(1)宫腔通畅试验显示,术后各组宫腔通畅率均为100%,各组间无差异。术后8周,胶原支架/人脐带间充质干细胞组子宫外观表面见丰富的血管,而胶原支架/PBS组与自然修复组子宫创面苍白,管腔塌陷。术后12周,胶原支架/PBS组与自然修复组子宫创面仍然苍白,部分创面出现疤痕挛缩;胶原支架/人脐带间充质干细胞组子宫表面外观已近正常子宫。(2)术后8周及12周对各组所取子宫进行HE染色,低倍镜下测量各组子宫内膜厚度,结果显示:术后8周,胶原支架/人脐带间充质干细胞组损伤区子宫内膜厚度与非手术区内膜厚度的比值(0.42±0.13),明显高于胶原支架/PBS组(0.16±0.12)与自然修复组(0.22±0.05);术后12周,各组内膜厚度比值与术后8周内膜厚度比值无明显改变,胶原支架/人脐带间充质干细胞组与其他两组之间仍有显著性差异。(3)免疫组化显示,胶原支架/人脐带间充质干细胞组损伤区新生腺体和微血管密度与非手术区域的比值明显高于自然修复组、胶原支架/PBS组。8周与12周新生腺体与非手术区域腺体数的比值分别是:胶原支架/人脐带间充质干细胞组,0.47±0.32和0.45±0.39;胶原支架/PBS 组,0.05±0.01,和 0.04±0.01;自然修复组,0.13±0.1 和 0.03±0.007。8周与12周血管密度与非手术区域血管密度的比值分别是:胶原支架/人脐带间充质干细胞组,0.58±0.07 和 0.59±0.20;胶原支架/PBS 组,0.295±0.12,和 0.42±0.21;自然修复组,0.24±0.15和0.30±0.14。但是在促进平滑肌修复方面,无论是术后8周还是术后12周,三组之间均没有显著性差异。(4)妊娠实验显示,胶原支架/人脐带间充质干细胞组手术区域着床率为55%,显著高于自然修复组的10%和胶原支架/PBS组的6.25%。结论:胶原支架复合人脐带间充质干细胞能够明显地促进小型香猪子宫内膜、血管和腺体的修复,有利于小型香猪损伤后子宫妊娠能力的恢复。第三章胶原支架负载人脐带间充质干细胞可以促进宫腔粘连综合征患者子宫内膜的修复和重建目的:研究负载人脐带间充质干细胞胶原支架治疗重度宫腔粘连综合征患者的临床试验方法:本研究为前瞻性无对照的单中心小样本临床实验。2014年11月至2015年6月,25位年龄在27-42岁之间,患有中、重度宫腔粘连综合征,有强烈生育愿望且无妊娠禁忌证的患者纳入本研究中。临床试验所用细胞为国家干细胞中心提供的“中国第一株临床使用级UC-MSC”。所有临床检查和手术均在月经周期的增殖晚期进行。采集了受试者病史、治疗经历,在治疗前和治疗后3个月的月经量、内膜厚度(多普勒超声测量)、宫腔镜下粘连程度和评分(美国生殖协会评分表AFS),以及内膜活检组织的免疫组织化学染色等信息进行治疗有效性的评估并密切随访受试者治疗前后月经量、内膜厚度变化及妊娠结局。结果:25位受试者中有2位受试者在接受治疗前宫腔镜检查活检的内膜组织中发现子宫内膜结核,因而接受了抗结核治疗;另有1位受试者接受细胞治疗后拒绝一切随访,因此这三位排除,共22位受试者治疗结果纳入统计。治疗前,22位受试者中有2位AFS在5-6分,为中度宫腔粘连;2位AFS7分,6位AFS 8分,12位AFS 10分,均为重度宫腔粘连。胶原支架/人脐带间充质干细胞治疗后,宫腔镜粘连评分降低,从治疗前的8.7±1.5降至治疗后的5.8±3.6(P<0.01)。其中1位中度、3位重度宫腔粘连受试者宫腔形态正常,未发现宫腔内粘连,AFS降为0;1位中度、4位重度宫腔粘连受试者宫腔粘连面积明显渐少,AFS降为4,评为轻度宫腔粘连;3位从重度变为中度;另有4位受试者虽仍为重度粘连,但其评分较治疗前有所下降,粘连面积有所减少;其余6位重度粘连受试者AFS评分无改变。总体而言,治疗后,宫腔粘连减少,AFS评分降低。子宫内膜厚度显著增加,治疗前后的内膜厚度分别为4.4±0.9mm和5.5±1.1mm(P<0.01)。受试者反馈月经量较治疗之前增加,月经期延长。子宫内膜活检组织的免疫组织化学检查结果显示,治疗后受试者子宫内膜组织ER-α,vimentin,Ki67表达量增加,vWF密度升高。治疗前后内膜组织中ER-α的阳性染色比例分别为0.03±0.02和 0.28±0.14;vimentin 的阳性染色比例分别为 0.08±0.05 和 0.46±0.20;Ki67 的阳性染色比例分别0.18±0.10和0.40±0.21;血管密度分别为7.97±2.89和18.36±7.43。至2017年2月,已有7位受试者成功受孕(1位中度宫腔粘连,6位重度宫腔粘连),其中5位已顺利产子,2位处于晚期妊娠中。已生产的5位受试者无胎盘并发症出现。结论:胶原支架/人脐带间充质干细胞能够明显促进重度宫腔粘连综合征患者子宫内膜再生性修复,促进血管再生,恢复内膜功能,这一全新的治疗方式为重度宫腔粘连综合征的临床治疗带来了新的治疗选择。