实验目的 皮肤创伤后的组织细胞再生修复及愈合，是由邻近、健在的细胞分裂、增殖来实现的。然而，大面积皮肤缺损如烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损、皮肤溃疡等，仅靠创面自身难以实现皮肤的再生，需要足够的皮肤替代物修复。临床常用的修复方法存在着许多缺点，如造成新的创面，并且当大面积皮肤缺损患者尤其是烧伤患者缺乏足够的自体皮肤，而异体皮移植存在免疫排斥反应。涉及真皮层的缺损由于愈合时间过长，缺乏表皮覆盖，出现感染、瘢痕的机率大大增加。因此能够快速覆盖创面，具有重要的理论价值和治疗意义。 干细胞技术的出现为解决这一难题提供了新的手段。干细胞具有自我复制的能力，在一定条件下，它可以分化成各种功能细胞。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的研究受到伦理学方面的困扰，细胞来源等方面的限制，因而成体干细胞的研究便受到人们的高度重视。越来越多的证据表明，骨髓间充质干细胞(MSCs)有多分化潜能，移植入体内后可分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、血管内皮、肝脏、神经等多种组织细胞。能够作为组织工程中不同细胞的来源；在体内正常循环中能够分布于多种组织和器官，可以用于细胞和基因治疗。而且取材、分离培养、扩增以及导入外源基因也相对方便。MSCs通过抽取自体骨髓得到，对病人造成创伤较少，且无免疫排斥反应。因此，MSCs在将来实际应用时就具有潜在的优势。 大多数观点认为，MSCS的分化与微环境密切相关。可能是不同组织的微环境中含有不同的因子，促进进入不同组织的MSCS获得靶组织的表型，向不同谱系分化。 本实验拟用猪骨髓间质干细胞体外分离培养，标记后回植到猪皮肤内以及在体外不同培养基的诱导下，进行分化诱导，观察在皮肤微环境中能否分化为皮肤的血管内皮细胞和表皮细胞，从而为皮肤组织的修复重建提供新思路。实验方法 一、猪MSCS的体外分离培养及鉴定 1、分离培养扩增:从成年健康小型香猪骼骨抽取骨髓，密度梯度离心分离后置沉淀细胞入培养液培养，24h后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，每隔3一4d换液，接近融合的MSCs按1:3比例传代培养，留取第三代备用。 2、MSCS的细胞周期检测:取传代生长良好的细胞，0.25%胰酶室温消化后制成细胞悬液，4OC预冷的乙醇固定30min，预冷的磷酸盐缓冲液(pBS)漂洗3次，1 mg/ml RNA酶37oC处理3omin，离心，加入IOmg/ml碘化丙咙，4℃避光染色巧min，流式细胞仪检测。 3、成骨诱导分化鉴定:细胞传代后，加入成骨诱导剂进行诱导。碱性磷酸酶(ALP)染色和von一kossa染色鉴定。 二、体外诱导MSCS分化为血管内皮细胞和上皮细胞 1、血管内皮细胞分化:第三代MSCS分别在以下各介质中培养:1.F一12培养液，含10%胎牛血清(Hyclone);2.F一12培养液，含10%胎牛血清，10ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)，Ing/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，2 ng/ml胰岛素生长因子(IGF)。 2、上皮细胞分化:第三代MSCS分别在以下各介质中培养:1 .F一12培养液，10%胎牛血清;2.F一12培养液，sng/ml表皮生长因子(EGF);3.F一12培养液，10%胎牛血清，sng/ml EGF;4，F一12培养液，10%胎牛血清，sng/m IEGF，30%条件培养基;5 .F一12培养液，10%胎牛血清，30%条件培养基。 诱导后3，7d进行第八因子(F姗)和广谱角蛋白(C Kp)免疫组织化学和流式细胞仪检测。 三、体内诱导分化1、动物模型:将体外培养、5一漠脱氧尿营(BrdU)标记的自体MSCs直接单次涂布到受试动物背部全厚皮肤缺损皮肤创面。并于术后不同时间点切取背部创面组织，制备切片。2、免疫组织化学染色 连续切片行BrdU、F硼、CKp免疫组化染色，光学显微镜下观察。3、免疫荧光化学染色 石蜡切片进行BrdU、FVlll、C助免疫荧光化学染色，激光共聚焦显微镜观察。 四、骨髓间充质干细胞移植提高猪皮肤修复质量的初步研究 1.动物分组及模型制作:小型香猪背部制备深H。烫伤创面，创面随机分组。将BrdU标记MSCS直接注射到受试动物皮肤真皮内。 2、创面面积测量:伤后7、14、Zld用透明膜覆盖创面并沿创缘画膜，剪膜，置分度值为o.lmg的天平称重换算成面积。 3、组织学观察:伤后14、21、42d分别取创面组织，常规石蜡制片，苏木素一伊红(HE)染色，S一100、BrdU、FVm免疫组化染色。相对定量结果判定。实验结果 一、MSCS的分离培养扩增及鉴定 1、骨髓单核细胞悬液接种于培养瓶后，原代细胞经过24h体外培养后有少量贴壁细胞，弃去悬浮细胞后继续培养，在4d内呈相对静止状态，之后细胞生长速度加快，并呈克隆样生长，呈长梭形，12d左右达到细胞融合，细胞形态呈比较均一。 2、细胞周期:流式细胞仪结果显示:MSCs中的S+GZ十M细胞约占20%，而处于GO/GI期的细胞为80%，及静止期细胞，只有少数的细胞处于活跃的增殖期。 3、MSCS成骨分化潜能的鉴定:成骨诱导14d后，细胞不明显，未形成钙结节;ZldALP钙钻法染色后大?