论文部分内容阅读
流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,它严重威胁人类生命健康。流感包括季节性流感和非季节性流感,普通季节性流感每年大约引起全球数十万人死亡。高致病性流感(主要是H5N1型)是近年来一直威胁人类生命健康的重大疾病,患者病死率极高。自2009年3月墨西哥和美国先后发生人感染H1N1病毒事件以来,甲型H1N1流感已在全球蔓延传播。
治疗流感已成为当前迫在眉睫的问题。神经氨酸酶抑制剂扎那米韦和奥斯米韦是目前仅有的两种治疗药物。N-乙酰-D-神经氨酸是化学合成扎那米韦的关键中间体,也是合成其他抗流感药物的主要原料。N-乙酰-D-神经氨酸目前由酶法催化合成。酶法催化的途径之一是首先由N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶将N-乙酰-D-葡萄糖胺异构化为N-乙酰-D-甘露糖胺,再由神经氨酸醛缩酶催化后者与丙酮酸之间的缩合而得到N-乙酰-D-神经氨酸。N-乙酰-D-神经氨酸的价格高昂(每公斤2万元),这就使得扎那米韦的价格居高不下。寻找高活性的酶,提高转化率是降低N-乙酰-D-神经氨酸的价格及至扎那米韦的价格关键因素。
酶法催化合成神经氨酸的成功实例为日本丸金食品有限公司Maru等研究人员以N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸为原料,经过在大肠杆菌中表达并纯化的猪肾来源的异构酶(pRnBP)和大肠杆菌来源的醛缩酶(Escherichia coli nanA)的催化,生成神经氨酸。目前存在的问题是:酶的活性仍相对较低、催化反应时间过长、转化率仍有提高的余地。同样重要的是,目前工业化生产的酶已被国外公司专利保护。
针对上述问题,本研究通过PCR手段克隆了三种新型的N-乙酰-D-葡萄糖胺异构酶,该酶是自将多拟形杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron VPI-54-82)的三段基因BT-0453、BT-3605及BT-0437克隆至表达载体pET30a(+)后,分别构建了质粒pLS125,pLS1005,pLS1006并在大肠杆菌中进行了表达。序列同源性比对发现,其与pRnBP的全长一致性,全长相似性均达到45％以上。利用PMP柱前衍生化法,通过高效液相色谱分析测定了三种异构酶的动力学参数,以及各自的Km、Kcat以及其比值。
以N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸为底物,选择三种相同来源的异构酶和大肠杆菌来源的神经氨酸醛缩酶进行了双酶偶联的催化实验。结果表明HisBT0453蛋白活性较高。以全细胞进行催化,37℃下反应12小时,生成N-乙酰-D-神经氨酸的摩尔收率为15％,质量收率为21.2％;以纯酶进行催化,37℃下反应12小时,生成N-乙酰-D-神经氨酸的摩尔收率为41.25％,质量收率为57.6％。
深入研究将进一步通过分子进化等手段来提高HisBT-0453的酶活,也可能挖掘工业化生产神经氨酸潜力,而这必将产生良好的经济效益和社会效益。